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1、第二章 酶的生物合成与发酵生产,提取分离法 微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法 生物合成法 植物细胞发酵产酶 化学合成法 动物细胞发酵产酶,第一节 酶生物合成及调节一、酶的生物合成,遗传信息传递的中心法则,转录传递给RNA，再由RNA,（一）RNA的生物合成-转录(transcription),定义 以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。,.,转录模板,启动子（promotor),终止子(terminator),模板链（template strand）反意义链(antisense strand),编码链(coding strand)有意义链(
2、sense strand),DNA,5,5,3,3,反意义链:指导转录作用的一条DNA链有意义链:无转录功能的一条DNA链.,T C G A G T A C,A G C T C A T G,C G A G U A C,G C A U,RNA聚合酶,有意义链,反意义链,RNA,PPi,5,5,3,GTP,UTP,CTP,ATP,UTP,RNA在DNA模板上的生物合成,3,3,5,RNA的转录过程(三步)分子生物学讲,1.起始2.延长3.终止,原核生物的RNA聚合酶(DDRP)E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（2）,起始因子,RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形
3、成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子（promotor),终止子(terminator),RNA链的延伸图解,定义 以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。,（二）蛋白质的生物合成-翻译(translation),AUG ACA,5,蛋,苏,UGU,GUU,3,受 位(A位),给 位(P位),大亚基,小亚基,蛋白质的合成过程（大肠杆菌）,1 基酸的活化2 肽链合成的起始3 肽链的延伸4 肽链合成的终止与释放,分子生物学讲,1 氨基酸的活化与转运,反应式：,AA+tRNA+ATP,氨酰-tRNA合成酶,氨酰-tRN
4、A+AMP+PPi,对于E.coli而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。,2 肽链合成的起始阶段,mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物 AUG与蛋氨酰-tRNA结合：30S-mRNA-IF3 fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。大小亚基结合,IF1,30S起始复合物,AUG ACA,5,3,AUG ACA,5,3,UAC,UAC,AUG ACA,5,3,小亚基,mRNA,蛋氨酰tRNA GTP,大亚基,GDP+Pi,受位,给位,蛋,蛋,肽链合成的起始阶段,3 肽链合成的延伸阶段,进位:氨基酰
5、-tRNA进入受位;转肽:形成肽键,在转肽酶作用下,给位与受位结合;移位:核蛋白体向3端移动一个密码子的位置,空 出受位,不断地进位、转肽、移位,使肽链延长。,AUG ACA,5,3,UAC,蛋,苏,UGU,AUG ACA,5,UAC,蛋,苏,UGU,GUU,AUG ACA,5,UAC,蛋,苏,UGU,GUU,AUG ACA,5,蛋,苏,UGU,GUU,3,3,3,GTP GDP+Pi,GDP+Pi,GTP,起始复合体,进位,转肽,移位,Mg+K+,4 肽链合成的终止阶段,出现终止密码并与终止因子结合;肽键水解,多肽释放;tRNA,mRNA,大小亚基解离.,AUG UAA,5,UAC,AUG
6、UAA,5,UAC,3,3,终,终,AUG UAA,5,UAC,3,终,5,3,UAC,终,肽链,二、酶生物合成的调节,定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。,（一）基因调控理论 Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）,基因操纵子调节系统示意图,调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因 DNA 转录（-）RNA聚合酶（+）转录 翻译 mRNA 翻译 阻遏蛋白 蛋白质 诱导剂,控制区 信息区,操纵子,cAMP-CRP复合物的作用示意图,启动基因（promotor ge
7、ne）（启动子）：有两个位点：（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又 称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。,操纵基因（Operater gene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（Structural gene）:决定某一多肽的DNA模板，
8、与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。,调节基因(regulator gene)：可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein)（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。,(二)酶合成调节的类型 1.诱导(induction)组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。2.阻遏(repression)分解代谢物阻遏(catabolite repression)反馈阻遏(feedback
9、repression),（三）酶合成的调节机制 1.酶合成的诱导:加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。如：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验:大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。,调节基因,操纵基因,乳糖结构基因,P,LacZ,LacY,Laca,mRNA,阻遏蛋白（有活性）,启动子,O,R,A、乳糖操纵子的结构,B、乳糖酶的诱导,诱导,2.末端产物阻遏:由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：实验：大肠杆
10、菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。,色氨酸操纵子酶的阻遏,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物,代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达,酶的诱导和阻遏操纵子模型,B.有活性阻遏蛋白加诱导剂,A.有活性阻遏蛋白,C.无活性阻遏蛋白,D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂,酶合成的诱导与阻遏操
11、纵子模型调控作用对比,3.分解代谢物阻遏,指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。,分解代谢物阻遏现象：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。,这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节
12、基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。,分解代谢物阻遏,R,LacZ,LacY,Laca,mRNA,CAP基因,结构基因,T,CAP,O,CAP结合部位,RNA聚合酶,T,cAMP-CAP,P,CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）,使CAP呈失活状态,三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）1.诱变育种(1)使诱导型变为组成型选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株 解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株 解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株 2.基因工程育种,（
13、二）条件控制 1.添加诱导物 酶的底物类似物最有效。2.降低阻遏物浓度 除去终产物 产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖 分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMP,3.添加表面活性剂 离子型 对细胞有毒害作 表面活性剂 Tween80 非离子型 增加细胞通透性 TritonX1004.添加产酶促进剂,思考题:1 名词:诱导物 终产物阻遏 分解代谢产物阻遏 葡萄糖效应 2举例说明酶生物合成调节机制在酶发酵过程优化中的指导意义.3举例说明酶生物合成调节机制在产酶微生物菌种改造中的指导意义.4在酶的发酵过程中,提高酶产量的措施有哪些?5说说微生物产酶菌种的要求 6如果筛选酸性蛋白酶高产菌株,如何进行筛选?7结合酶生物合成模式,谈谈如何提高酶的合成量?,
