酶组织化学应用.ppt

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1、酶组织化学-水解酶及氧化还原酶 组织化学原理及方法,组织化学,狭义 应用化学和物理学原理在组织切片上，加入某种试剂使其与组织切片中欲检测的物质发生反应，最终形成有色沉淀，在显微镜下观察，以研究组织细胞结构与功能之间的关系。,1.基本原理,细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物）然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物 该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在,显示酶的组织化学方法1.金属沉淀法：磷酸酶的显示 甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法,酸性磷酸酶,底物 酶,初级反应产物-不易扩散,重氮盐,最终反应产物

2、-呈色,偶氮偶联法 Gomori萘酚磷酸酯法-AKP在碱性条件下将-萘基磷酸钠水解出-萘酚,随后-萘酚与固蓝B盐在酶活性部位偶联,形成紫红至紫黑色的不溶性沉淀【孵育液】-萘基磷酸钠,蒸馏水,5%四硼酸钠,10%硫酸镁,固蓝B盐 六偶氮对品红与-萘酚偶联-以萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氮对品红。（偶联人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素）【孵育液】萘酚AS-BI磷酸钠,二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO),Tris-cl或巴比妥醋酸缓冲液,六偶氮对品红,【操作步骤】1.小块组织液氮骤冷,低温冰箱切片2.甲醛钙液(F

3、ca)固定5分钟,4,然后蒸馏水洗,也可不固定3.作用液560分钟,37或室温4.蒸馏水洗5.4%甲醛固定15分钟2小时,室温6.自来水洗,蒸馏水洗7.1%甲基绿(氯仿洗过)510分钟,蒸馏水洗8.甘油明胶封片,或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀,核呈蓝绿色,酶的种类,1.氧化还原酶 2.转移酶 3.水解酶 4.裂合酶 5.异构酶 6.合成酶,水解酶-一类增加或去除水，催化水解反应的酶 AB+H2O AH+BOH,（一）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）又称碱性磷酸单酯酶（）在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解 最适PH 9.29.4

4、 激活剂:如Mg+,Mn+,某些氨基酸等 抑制剂:氰化物、砷酸盐等 分布：广泛存在于机体组织，常见于具有活跃转运功 能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘 应用：1.肝脏病、白血病的研究诊断 2.骨的发生和代谢疾病的研究中,显示碱性磷酸酶的常用方法:1.钙钴法(Gomori-Takamatsu法)【基本原理】甘油磷酸钠 磷酸酯+Ca+磷酸钙 磷酸钴 硫化钴【孵育液】2%巴比妥钠,3%-甘油磷酸钠,2%无水氯化钙,5%硫酸镁,AKP,【操作步骤】1.新鲜组织低温冰冻切片 2.不固定切片直接进作用液,或用1%氯化钙Formalin(Fca)固定5分钟2

5、 小时,4,蒸馏水洗 3.作用液1060分钟,37 4.蒸馏水洗 5.2%硝酸钴1分钟 6.蒸馏水洗 7.12%硫化铵1分钟 8.蒸馏水洗 9.甘油明胶封片,或脱水,透明,中性树胶封片【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀,肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法 X100,肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法 X200,(二)酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解 最适PH 为4.85.2 抑制剂因组织差异而不同:酒石酸,氟化物,0.5%甲醛 分布:主要位于溶酶体内 应用:前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+)Hodgins淋巴,胃癌,肺癌,乳腺癌等(+)尤文氏

6、瘤,成骨肉瘤等(-),显示酸性磷酸酶的常用方法1.酸性磷酸酶硝酸铅法【基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅（黑色）【孵育液】硝酸铅，巴比妥-硝酸盐缓冲液，-甘油磷酸钠【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色2.同时偶联法【基本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚AS-TR和磷酸,萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶联,在酶活性处形成红色的不溶性复合物【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯,六偶氮对品红,ACP,【操作步骤】1.新鲜组织低温冰箱切片2.不固定或吹干后丙酮固定15分钟3.用孵育液置于37水浴箱12小时4.流水洗,晾干(12分钟)5.用Mayer苏

7、木精或1%甲基绿复染6.流水洗10分钟7.常规脱水透明,中性树胶封片【结果】酸性磷酸酶活性处呈桔红色.胞核兰色(苏木精复染)或绿色(甲基绿复染),涂片-腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶 X400,(三)5核苷酸酶(5nucleotidase)催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在C-5位置水解磷酸酯的水解酶 最适PH因组织而异。小鼠肾为7.5,睾丸、脑、肝分别为8.5、7.58.5、8.0 激活剂：Mg+，Mn+抑制剂：氟化钠（0.1M NaF），硼酸钠,OH,OH,H,O,H,OH,H,OH,H,碱基(嘌呤、嘧啶）,（H）,+H2O,Pi,5Nase,HO-CH2,O,H,H,OH,H,OH,（H）,H,碱基,

8、CH2,O,P,HO,5核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶5核苷酸酶的显示-铅法【基本原理】5Nase水解底物5单磷酸腺苷AMP 磷酸+铅 磷酸铅 硫化铅（黑色）【注意】5核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶相似 5Nase AKP1.肾组织中分布 肾小管刷状缘(+),所有 仅肾小管刷状缘(+)基膜也(+)2.-甘油磷酸钠()(+),5Nase,作为底物,(四)葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-p-酶)肝细胞特有的功能性酶,分解糖原,维持血糖浓度,是糖代谢的关键酶 PH6时活性最强,PH8时最稳定,PH5时易变性 组化反应PH6.56.7 抑制剂:氟化物,锌和氰离

9、子 酒精固定,石蜡包埋后,G6p酶被完全抑制;经甲醛固定而失活 硝酸铅法显示G6p酶:葡萄糖-6-p 葡萄糖+磷酸 磷酸铅 硫化铅,G6p酶,(五)腺苷三磷酸酶又称ATP酶 ATP ADP+Pi+能量 根据所用激活剂、抑制剂以及酶定位的不同，可分为三类ATP酶1.肌球蛋白腺苷三磷酸酶定位于骨骼肌最适PH为9.0 9.4被Ca+激活,而被Mg+抑制常用作区分二型肌纤维:型(红肌)-收缩慢,活动持久,其酶活性高,染色深 型(白肌)-收缩快,活动不持久,其酶活性低,染色淡,ATPase,2.膜性腺苷三磷酸酶 又称钠-钾离子激活腺苷三磷酸酶 最适PH7.2 7.5 激活剂:Mg+,Na+,K+抑制剂:

10、Ca+,苦毒毛旋花子甙 常存在于细胞膜,特别是分泌功能活跃的细胞膜。3.线粒体腺苷三磷酸酶 心肌最丰富，肝脏次之 心肌的线粒体ATP酶被Mg+激活，而被Ca+抑制,肝细胞线粒体ATP酶可同时被Mg+、Ca+激活 心肌和肝的线粒体ATP酶均可被对-氯汞苯甲酸（PCMB）抑制 种类 定位 最适PH 激活剂 抑制剂肌球蛋白ATP酶膜性ATP酶线粒体ATP酶,腺苷三磷酸酶的显示方法1.镁激活的ATP酶法(铅法):在ATP酶活性处,出现棕黑色的硫化铅沉淀。主要用于显示膜性ATPase，也可示线粒体ATPase2.钙激活的ATP酶法(钙钴法):在ATP酶活性处,出现黑色硫化钴沉淀。主要用于显示肌球蛋白AT

11、Pase，区分红肌纤维和白肌纤维,（六）非特异性酯酶酯酶可分为三类非特异性酯酶、脂酶、胆碱酯酶非特异性酯酶-水解短链脂肪酸的酯脂酶-水解长链脂肪酸的酯胆碱酯酶-水解胆碱的酯酶 非特异性酯酶 最适PH 5.0 8.0 定位在溶酶体和内质网,在肝、肾、胰和小肠具有较高的酶活性,应用-单核巨噬细胞、T淋巴、中性粒细胞都有非特异性酯酶反应 1.在急性白血病分类诊断时，非特异性酯酶含量多少、有无颗粒及颗粒大小，都有一定的诊断价值 2.可作为T、B淋巴细胞的鉴别显示非特异性酯酶法-同时偶联法 用乙酸-萘酯或萘酚AS衍生物为底物，在酶作用下，释出-萘酚，与固蓝B或六偶氮对品红偶联，生成紫黑色或红棕色不溶的偶

12、氮染料,（七）胆碱酯酶 乙酰胆碱酯酶-神经组织、肌肉、红细胞中 胆碱酯酶-血浆中含量丰富 显示乙酰胆碱酯酶的方法Karnovsky-Rotts亚铁氰化铜法【基本原理】碘化乙酰硫化胆碱 硫代胆碱+乙酸 铁氰化钾 亚铁氰化钾 亚铁氰化铜沉淀,乙酰胆碱酯酶,（-SH）,Cu+,氧化还原酶-这是一类转移电子，催化作用物的氧化还原反应的酶 脱氢酶 如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶 氧化酶 如DOPA氧化酶、细胞色素氧化酶,（一）脱氢酶 脱氢酶的显示：底物为脱氢酶氧化，从底物释放出氢，经氢传递系统，使受氢体还原而显色常以四唑盐和铁氰化钾作为受氢体 组化示脱氢酶分为不需辅酶和必需辅酶二种,1.瑚珀酸脱氢酶（SDH

13、）SDH是属于琥珀酸氧化酶系统的酶。不需辅酶的存在 SDH存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富，和线粒体膜牢固结合 最适PH 7.【显示方法】Pearson 二甲亚砜法【基本原理】琥珀酸盐+受氢体（四唑盐）富马酸+还原的受氢体（无色）（蓝色沉淀）,【作用液】0.1M 琥珀酸钠,0.1M 磷酸盐缓冲液 PH 7.6 NBT(硝基蓝四唑),二甲亚砜(DMSO)【步骤】1.新鲜组织低温冰冻切片 2.作用液1535 分钟 3.生理盐水洗 4.Fca(氯化钙Formalin)固定10分钟 5.入80%乙醇5分钟 6.甘油明胶封固或脱水、透明、中性树胶封片【结果】酶活性处为蓝

14、紫色沉淀,小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶 X400,2.乳酸脱氢酶（LDH）需辅酶的脱氢酶 广泛分布的可溶性酶，为糖原分解的酶系 最适PH 7.4 肝、骨骼肌的酶活性高于心肌【基本原理】催化乳酸和丙酮酸的互变反应 乳酸盐+NAD 丙酮酸盐+（NADH+H+）,LDH,（辅酶）,（还原型辅酶）,（二）过氧化物酶 催化各种物质被过氧化氢（H2O2）所氧化 见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等 髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要 免疫组化中常用辣根过氧化物酶（HRP）作为大分子示踪剂【显示方法】二氨基联苯胺法示过氧化物酶【基本原理】过氧化物酶作用于底物（3，3-二氨基联苯胺，DAB），催化底物被H2O2氧化，生成棕色的沉淀【作用液】DAB，Tris-cl缓冲液，H2O2【结果】酶活性处呈棕色,小鼠腹腔巨噬细胞-过氧化物酶*400,白血病涂片-过氧化物酶 X400,