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1、红外分光光度法1简述化合物受红外辐射照耀后，使分子的振动和转动运动由较低能级向较高能及跃迁，从而导致对特定频率红外辐射的选择性汲取，形成特征性很强的红外汲取光谱，红外光谱又称振-转光谱。红外光谱是鉴别物质和分析物质化学结构的有效手段，已被广泛应用于物质的定性鉴别、物相分析和定量测定，并用于讨论分子间和分子内部的相互作用。习惯上，往往把红外区分为3个区域，近红外区（1280040000cm/,0.782.5m）,中红外区（4000400cm”,2.525m）和远红外区（40010cm/,251000m）o其中中红外区是药物分析中最常用的区域。红外汲取与物质的关系在肯定范围内听从朗伯-比尔定律，因
2、而它也是红外分光光度法定量的基础。红外分光光度计分为色散型和傅里叶变换型两种。前者主要由光源、单色器（通常为光栅）、样品室、检测器、纪录仪、掌握盒数据处理系统组成。以光栅为色散元件的红外分光光度计，以波数为线性刻度，以棱镜为色散元件的仪器，以波长为线性刻度。波数与波长的换算关系如下：10000波数（cm）=波长（Um）傅里叶变换型红外光谱仪（简称FT-IR）则由光学台（包括光源、干涉仪、样品室和检测器）、纪录装置和数据处理系统组成，由干涉图变为红外光谱需经快速傅里叶变换。该型号仪器现已成为最常用的仪器。2红外分光光度计的检定所用仪器应按现行我国质量与核查技术监督局“色散型红外分光光度计鉴定规程
3、”、傅里叶变换红外光谱仪鉴定规程和中国药典附录规定，并参考仪器说明书，对仪器定期进行校正检定。2.1 波数精确度波数精确度的允差范围傅里叶变换红外光谱仪在3000cm-,四周的波数误差应不大于5cm,在1000CmJ四周的波数误差应不大于土ICm。2.1.2波数精确度检定方法.1以聚苯乙烯膜校正按仪器使用说明书要求设置参数，以常用的扫描速度纪录厚度为50m的聚苯乙烯膜红外光谱图。测量有关谱带的位置，其汲取光谱图应符合药品红外光谱集所附聚苯乙烯图谱的要求，并与参考波数（表1）比较，计算波数精确度。表1聚苯乙烯汲取谱带常用的波数值波数(cm,)波数(cm,)3027.11583.12850.711
4、54.31944.01028.01801.61601.4906.7.2以液体池用液体荀校正液体荀在3900690cmJ范围内有较多的汲取峰可资比较,适于测定中等辨别率的仪器。一般需用适当液层厚度的固定厚度密封液体池，选用液体池的窗片材料应能保证在测定波数范围内有良好的红外光透过率，窗片应有良好的光滑度和平面平行度，注样品时将液体池放在一楔形板上，打开2个进样孔塞，把样品用专用注射器从下部进样孔缓缓注入。同时观看池内液面缓缓提升而不夹带气泡，至液体在上进样孔内接近满溢时，取下注射器，先盖好下进样孔塞，再盖上上进样孔塞，吸去外溢液体后即可在仪器上测定汲取光谱，其主要谱带见表2.表2茴主要汲取谱带的
5、波数值（50m液层，cm）3926.53139.52771.01915.31553.21361.11205.11018.5830.5590.82.2 波数重现性用与2.1波数精确度测量相同的仪器参数，对同一张聚苯乙烯膜进行反复重叠扫描。一般扫描35次。从扫描所得光谱测定波数的重现性。测得的各汲取峰的重现性应符合现行我国技术监督局的要求。2.3 辨别率以聚苯乙烯膜检定。色散型红外仪用常规狭缝程序，通常的扫描速度，或以较窄的狭缝程序用较慢的扫描速度，纪录聚苯乙烯的图谱。傅里叶红外仪设置于2cm“辨别率和相宜的扫描次数,依法纪录光谱图。在31102850cm-1范围内，应能显示7个汲取带，其中峰28
6、51cm/与谷2870cm的辨别深度应不小于18%透光率；又峰1583cm4与谷1589cm-,之间的辨别深度应不小于12%透光率。的标称辨别率，应不低于2cm。2.4 100%线平直度调整100%掌握旋钮，使纪录笔置于95%透光率处，以快速扫描速度扫描全波长段，其100%线的偏差应小于4%透光率。2.5 噪声调整100%掌握旋钮，使纪录笔置于95%透光率处，在100OCmj处定波数连续扫描5min,其最大噪声（峰-峰值）应小于1%透光率。2.6 其他杂散光水平和透光率精确度检查，因需要特殊器件，且对药品测定影响不大，故不作硬性要求，3红外光谱测定操作方法红外光谱测定技术分两类。一类是指检测方
7、法，如透射、衰减全反射、漫反射、光声及红外放射等；另一类使之制样技术。在药物分析中，通常测定的都是透射光谱，采纳的制样技术主要有压片法、糊法、膜法、溶液法、衰减全反射法和气体汲取池法等。3.1 压片法取供试品约l1.5mg,置玛瑙研钵中，加入干燥的溟化钾或氯化钾细粉约200300mg（与供试品的比约为200:1）作为分散剂，充分研磨混匀，置于直径为13mm的压片磨具中，使铺展匀称，抽真空约2min,加压至（0.8x106）kPa（约8-10Tcm2）,保持压力2min,撤去压力并放气后取出制成的供试片，目视检测，片子应呈透亮状，其中样品分布应匀称，并无明显的颗粒状样品。亦可采纳其他直径的压模制
8、片，样品与分散剂的用量需相应调整以制的浓度适合的片子。3.2 糊法取供试品约5mg,置玛瑙研钵中，粉碎研细后，滴加少量液状石蜡或其他相宜的糊剂，研成匀称的糊状物，取适量糊状物夹于量窗片或空白演化钾片（每片约150mg）之间，作为供试片，另以溟化钾约300mg制成空白片作为补偿。亦可用专用专职夹持糊状物。制备时应留意尽量使糊状样品在窗片间分布匀称。3.3 膜法参照上述糊法所述的方法，将能形成薄膜的液体样品铺展于相宜的盐片中，使形成薄膜后测定。若为高分子聚合物，可先制成相宜厚度的高分子薄膜，直接置于样品光路中测定。熔点较低的固体样品可固体样品可采纳熔融成膜的方法制样。3.4 溶液法将供试片溶于相宜
9、的溶剂中，制成l%10%浓度的溶液，灌入相宜厚度的液体池中测定。常用溶剂有四氯化碳、三氯甲烷、二硫化碳、己烷、环己烷及二氯乙烷等。选用溶液应在被测定区域中透亮或仅有中至弱的汲取,且与样品间的相互作用应尽可能小。3.5 气体汲取池法测定气体样品需要使用气体汲取池，常用气体汲取池的光路长度为10cm。通常先把气体汲取池抽空，然后充以适当压力（约50mmHg）的供试品测定。也可用注射器向气体汲取池内注入适量的样品，待样品完全气化后测定。3.6 衰减全反射法（ATR）取供试品适量，匀称地铺展在衰减全反射棱镜的底面上，使紧密接触，依法录制反射光谱图。本法适用于纤维、高分子聚合物等粉碎的样品。3.7 试样
10、的制备方法出另有规定外，用作鉴别时应依据药典委员会编订的药品红外光谱集第一卷（1995年版）、其次卷（2000年版）、第三卷（2005年版）和第四卷（2022年版）收载的各光谱图所规定的制备方法制备。详细操作技术可参见药品红外光谱集的说明。当新卷收载旧卷相同谱号的光谱图时，旧卷图谱作废。用作晶型、异构体限度检查或含量测定时，试样制备和详细测定方法均按药典各品种项下有关规定操作。4供试品的测定4.1 原来要的鉴别采纳固体制样技术时，最常遇到的问题是多晶型现象，固体样品的晶型不同，其红外光谱往往也会产生差异。当供试品的实测光谱与药品红外光谱集所收载的对比图谱不全都时，在排解各种可能影响光谱的外在或
11、认为因素后，应按该药品光谱图中备注的方法或各品种项下规定的方法进行预处理，再绘制光谱，进行比对。如未规定该品种在相同的条件下同时进行重结晶，然后一发绘制光谱，进行比对。如已规定特定的药用晶型，则应采纳相应晶型的对比品依法进行比对。当采纳固体制样技术不能满足鉴别需要时，可改用溶液法绘制光谱后对比。4.2 制剂的鉴别分类.1不加辅料的制剂如无菌原料直接分装的注射用粉针剂及不加辅料的冻干剂和胶囊剂等其他成品，可直接取内容物绘制光谱图进行鉴别。.2单方制剂一般采纳简洁的提取分别手段就能有效去除辅料，可依据不同剂型的特点选择不同的分别提取方法，取干燥后的提取物绘制光谱图进行鉴别。.3复方制剂一般状况比较
12、简单，依据详细问题详细分析。前处理.1预处理对可能影响样品红外光谱的部分，在提取前应尽量去除，如对于报以制剂应先去除包衣，双层片将二层分开等。.2提取一般按各品种项下规定的方法对待测成分进行分别提取。如品种项下未规定提取方法，对国外药典已收载有红外光谱鉴别的制剂或有其他相关文献资料的品种，可参考相关文献方法进行处理。对于无文献资料的药物制剂，可依据活性成分和辅料的性质选择适当的提取方法。首选易挥发、非极性的有机溶剂为提取溶剂，如乙酸、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、石油酸、乙醇、甲醇等；如标准光谱集中有转晶方法，或可获得原料药的精制溶剂，最好选用与转晶方法相同的溶剂或精制溶剂。若首选溶剂不
13、适用，可考虑混合溶剂。一般所选溶剂为无水溶剂，提取时有机层可加无水硫酸钠除去水分。依据活性成分和辅料的溶解度不同，通过选择适合的溶剂即能提取活性成分又能去除辅料，则采纳直接提取法。对于多数药品，一般选用的常用溶剂如水、甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醛、石油酸等就能基本达到分别效果,非极性溶剂的效果比极性的好。一般非电离有机物质（不是有机酸或有机碱的盐）采纳此法可获得满意的结果。如冻干制剂常用辅料均不溶于乙醇和甲醇，用醇提取均能获得满足结果；辅料只有水的的液体蒸干水分后绘制红外光谱。对于液体或半固体制剂宜选择萃取法，可依据活性成分和辅料性质选用直接萃取法，当有机酸或有机碱的盐类药物经直
14、接提取法不能够火的满足的光谱图时，一般采纳经酸化（或碱化）后再萃取的方法，但需与火星物质（基）的红外光谱进行比对。含有待测成分的提取溶液经过滤后，可选择析晶、蒸干、挥干等方法火的待测成分；必要时可经洗涤、重结晶等方法纯化。干燥可依据药品红外光谱集备注中的干燥方法对待测成分进行干燥，也可采纳各品种项下的干燥失重方法或参考（中国药典2022年版二部附录VlIIL）干燥失重测定法项下的方法进行干燥，可视待测成分状况适当增减干燥时间。图谱比对.1辅料无干扰，待测成分的晶型不变化，此时可直接与对比品图谱或对比图进行比对。.2辅料无干扰，但待测成分的晶型有变化，次中状况可用对比品经同法处理后的图谱比对。.
15、3待测成分的晶型不变化，而辅料存在不同程度的干扰，此时可参照原料药的对比图谱，在指纹区内选择35个不受辅料干扰的待测成分的特征谱带作为鉴别的一句。鉴别时，实测谱带的波数误差应小于规定值的0.5%。4.2.4.4待测成分的晶型有变化，辅料也存在干扰，此种状况一般不宜采纳红外光谱鉴别。4.3多组分原料药的鉴别不能采纳全光谱比对，可借鉴.3的方法，选择主要成分若干个特征谱带，用于组成相对稳定的多组分原料的鉴别。4.4晶型、异构体的限度检查或含量测定供试品制备和详细测定方法均按各品种项下有关规定操作。5测量操作留意事项5.1 环境条件红外式的室温应掌握在1530C,相对湿度应小于65%,适当通风换气，
16、以免积聚过度的二氧化碳和有机溶剂蒸汽。供电电压和接地电阻应符合仪器说明书要求。5.2 背景补偿或空白校正纪录供试品光谱时，双光束仪器的参比光路中应置相应的空白对比物（空白盐片、溶剂或糊剂）；单光束仪器（常见的傅里叶变换红外仪）应先进行空白背景扫描，扫描供试品后扣除背景汲取，即得供试品光谱。5.3 采纳压片法时，以漠化钾最常用，若供试品为盐酸盐，可比较氯化钾压片和澳化钾压片法的光谱，若而这没有区分，则使用溟化钾。所用的澳化钾或氯化钾在中红区应无明显的干扰汲取；应预先研细，过200目筛，并在120C干燥4h后分装并在干燥器中保存备用。若发觉结块，需重新干燥。5.4 供试品研磨应适度，通常以粒度25
17、m为宜。供试品过度研磨有时会导致晶格结构的破坏或晶型的转化。粒度不够细则易引起光散射能量损失，使整个光谱极限倾斜，甚至严峻变形。该现象在4000-2000cm,高频端最为明显。压片法及糊法中最易发生这种现象。5.5 压片法制成的片厚在0.5mm左右时，常可在光谱上观看到干涉条纹，对供试品光谱产生干扰。一般可将片厚调整至0.5mm以下即可减弱或避开。也可用金相砂纸将片略微打毛以去除干扰。5.6 测定样品时的扫描速度应于波长校正的条件全都（快速扫描将使波长滞后）。制成图谱的最强汲取峰透光率应在10%以下，图谱的质量应符合药品红外光谱集的要求。5.7 使用预先印制标尺纪录纸的色散型仪器，在制图时应留
18、意纪录笔在纸上从横坐标的位置与仪器示值是否相符，以避开因图纸对准不良引起的误差。5.8 压片模具及液体汲取池等红外附件，使用完后应准时擦拭洁净，必要时清洗，保存在干燥器中，以免锈蚀。5.9 关于样品的纯度提取后获刑成分的纯度在90%95%的范围内就能基本满足制剂红外鉴别的要求。5.10 建立自己的光谱库不同仪器间峰波数和更的强弱会有微小差别，建议各试验室建立自己的光谱库，用仪器自带软件计算与参考图谱的全都性。导数光谱能够极大的增加推断的精确性。5.11 波数的偏差低于100Ocm波数的偏差不超过0.5%,其他波数的偏差不超过10Cm-Io5.12 整体性红外光谱与分子结构有亲密的关系，谱带之间
19、相互关联，特殊是指纹区体现的是整体结构。图谱比较时，应主要从整体上比较谱带最大汲取的位置、相对强度和性状与参考图谱的全都性。6结果判定红外光谱在药品分析中，主要用于定性鉴别和物相分析。定性鉴别时，主要着眼于供试品光谱与对比品光谱全谱谱形的比较，即首先是谱带的有与无，然后是各谱带的相对强弱。若供试品的光谱图与对比光谱图全都，通常可判定量化合物为同一物质（只有少数例外，如有些光学异构体或大分子同系物等）。若两光谱图不同，则可判定量化和不同。但下此结论时，须考虑供试品是否存在多晶现象，纯度如何，乙基其他外界因素的干扰。采纳固体样品制备法，如遇多晶现象造成的实测光谱与对比光谱又差异时，一般可按药品红外光谱集中所载重结晶处理法或与对比品平行处理后测定。但如对药用晶型有规定时，则不能自行重结晶。其他影响常可通过修改制样技术而解决。由于各种型号的仪器性能不同，试样制备时研磨程度的差异或吸水程度不同等缘由，均会影响光谱的性状。因此，晶型光谱比对时，应考虑各种因素可能造成的影响。7常见的外界干扰因素7.1 大气汲取。二氧化碳2350cm-,667Cm-1。7K汽3900-3300cm-,18001500cm。溶剂蒸汽。7.2 干涉条纹规律性的正弦形曲线叠加在光谱图上。7.3 仪器辨别率的不同和不同研磨条件的影响。
