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1、2023从受精卵到囊胚期胚胎在体外培养发育过程中的乳酸代谢摘要体外受精-胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer,IVF-ET)是将精子和卵子在体外受精结合，并在体外进行胚胎培养发育至卵裂期或囊胚期胚胎，再移植到子宫内的过程。通常把受精卵到着床前囊胚期的发育过程称之为胚胎着床前发育。一般认为，人的胚胎着床前发育是靠卵母细胞蓄积的蛋白和mRNA发育至8-细胞期，然后开始激活胚胎自体基因进一步发育到囊胚期。由此可见，WF技术治疗不孕不育的重要环节之一是着床前胚胎体外培养。体外培养液的成分会直接影响着床前胚胎发育和临床治疗结局。其中，乳酸可能在受精卵早期分
2、裂发育过程中起了相对重要作用。本文对受精卵到囊胚期胚胎着床前体外培养液的发展过程和培养液中的乳酸成分对胚胎着床前发育的影响进行概述。同时，对培养液中乳酸成分来源的乳酸盐原料进行简单的介绍。【关犍词】受精卵；囊胚；胚胎着床前发育；胚胎自体基因；乳酸；培养液卵母细胞受精后，由合子开始发育到着床前囊胚，通常这个过程称之为胚胎着床前发育。人的受精卵(合子)到囊胚期胚胎着床前发育需要56d的时间。一般来说，人的胚胎着床前发育是靠卵母细胞本身蓄积的蛋白和mRNA发育至8-细胞期，然后才开始激活胚胎自体基因进一步发育1o人的胚胎发育至16-细胞期时开始细胞间密切接触致密化，并分化为内细胞团和滋养层，进而形成
3、囊胚。着床后内细胞团分化发育成胎儿，滋养层则分化发育成胎盘。自1978年世界第一例试管婴儿诞生以来，人体外受精-胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer,IVF-ET)技术已让上千万不孕不育夫妇解决了生育问题。众所周知，WF技术治疗不孕不育包括几个重要环节，其中一个关键环节就是胚胎着床前的体外培养，因为胚胎着床前体外培养直接影响到IVF结局。胚胎的体外培养技术源于其他细胞和组织模拟体内稳态培养技术的发展。为此，胚胎体外培养体系被认为有以下四个关键因素：温度保持；酸碱度平衡；细胞体积的渗透压维护；防止污染。随着对从受精卵到囊胚期胚胎代谢产物的研究进展，
4、体外培养液改良技术也得到了长足的发展，尤其是通过对培养液的成分改进，使胚胎着床前体外培养囊胚发育率已经达到较高水平。一般认为，在胚胎培养液成分中，乳酸在早期的受精卵分裂发育过程中起了相对重要作用。本文对胚胎着床前体外培养液的发展历程和乳酸在胚胎体外培养液中的相对重要性作一综述。一.胚胎体外培养液的发展历程大约在140年前，Ringer2发明了以生理盐水为基础液添加血清的林格尔培养液，用以体外培养蛙类心脏。Tyrode3在林格尔培养液中添加磷酸二氢钠和氯化镁，同时增加碳酸氢钠浓度来体外培养兔类肠子。Krebs-RingersBicarbonate(KRB)培养液中的25mmol/L碳酸氢钠浓度就
5、是今天大多数培养液中的浓度，用5%C02气相环境来维持培养液在培养过程中的酸碱度(PH)4oHammond5用林格尔培养液为基础液，添加葡萄糖和5%蛋白来对小鼠胚胎进行了体外培养，并首先报道小鼠胚胎可在体外培养致密化和发育成囊胚，证明培养液中的葡萄糖是必需成分。Whitten6进一步研究证明,在KRB培养液中添加5.55mmol/L葡萄糖、青霉素、链霉素和牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)可以使小鼠90%的8-细胞期卵裂胚发育成囊胚。进而,Whitten7报道在他的培养液中添加乳酸可以使小鼠2-细胞期卵裂胚发育成囊胚，但是不能使小鼠单细胞的受精卵进一步发育，也就是小鼠
6、的2-细胞期卵裂胚具有阻滞现象。后来证明，其他哺乳动物的卵裂胚在体外发育培养过程中也有这种阻滞现象，而体外培养人的胚胎在8-细胞期具有这种发育阻滞现象1,8-9。一般认为，这种体外培养发育阻滞现象与胚胎自体基因激活(zygotegenomeactivation,ZGA)有直接关系,因为人的精卵结合后胚胎自体基因是在8-细胞期开始被激活表达的1l所以这一时期更容易受到体外培养环境的影响10。Brinster11进行了一系列体外发育培养研究，报道磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、乳酸和草酰乙酸可以支持小鼠2-细胞期卵裂胚发育到8-细胞期，但是从8-细胞期胚胎体外培养液中需要有葡萄糖成分来支撑发育成囊胚12-
7、13在BrinSter培养液基础上,Chatot等14去除体外培养液中的葡萄糖成分，添加LOmmol/L谷氨酰胺和0.1mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)配制了Chatot-Ziomek-Bavister(CZB)培养液，报道由此解决了小鼠2-细胞期胚胎体外发育阻滞现象。如前所述，体外培养胚胎发育使用的培养液是基于简单的林格尔培养液而发展起来的。这是根据还原自然理论来模拟培养环境，尤其是分析输卵管液(humantubalfluid,HTF)和子宫腔液成分基础上设计出来的15。继而，又有人根据胚胎发育不同时期可能需要不同代谢物质所设
8、计出序贯式胚胎体外发育培养液16。然而，体内稳态与体外培养环境大不相同，为此有学者认为要根据胚胎体外培养发育需要进行设计培养液成分17。基于胚胎体外发育需要理论，有人在CZB培养液的基础上，把氯化钾浓度由025mmol/L增加到2.5mmol/L,显示可以提高小鼠囊胚形成率18,同时指出小鼠2-细胞期胚胎体外培养发育阻滞是由培养液中高浓度氯化钠成分所造成19o由此，设计出小鼠胚胎体外发育培养液-钾离子简单优化培养液(K+simplexoptimisedmedium,KSOM)20z并且证明培养液成分中的葡萄糖不会阻滞胚胎体外发育，而是具有促进囊胚发育效果21。进一步研究也证明，小鼠的KSOM体
9、外发育培养液中添加氨基酸成分可以有效地提高胚胎体外培养效果22-24o体外发育培养液成分中的谷氨酰胺或丙氨酰-谷氨酰胺可被甘氨酸-谷氨酰胺二肽替代，得到同样的胚胎体外培养发育效果25-26。虽然根据胚胎体外培养发育需要所设计的小鼠KSOM体外发育培养液，添加氨基酸后在人的胚胎体外培养发育过程中得以验证8,但是人的胚胎毕竟不是小鼠胚胎，两者之间还是具有很大的差异，为此有许多不确定因素还需要进一步确认和验证。由此可见，人的胚胎体外培养液的发展经过了较为漫长时间的探索，主要是基于小鼠等哺乳动物的受精卵到囊胚期着床前胚胎体外培养发育发展而来。目前在国际上，有许多IVF培养液生产厂家进行商品化生产着床前
10、人胚胎体外培养液，然而，各个厂家生产的培养液配方成分不尽一致，并且具有不同的培养效果和稳定性9。下面我们仅对胚胎体外培养液中的乳酸作用进行简单的讨论。二.从受精卵到囊胚期的乳酸代谢早期的研究对胚胎的能量代谢和胚胎体外培养液的能量需要有了初步认识，尤其是对小鼠的研究证明，从单细胞的受精卵到2-细胞期胚胎体外发育培养液的能源物质中，丙酮酸是必需物质11。早期的研究认为，虽然体外发育培养液中添加乳酸可以使小鼠受精卵发育至2-细胞期卵裂胚7,27,但是体外发育培养液中添加的乳酸成分本身不能支持胚胎的进一步发育，证明小鼠4-细胞/8-细胞期胚胎只能利用培养液中葡萄糖才可以促使体外培养发育成囊胚28。这些
11、早期的研究表明，小鼠的单细胞期受精卵到2-细胞期胚胎在有效地消耗丙酮酸，从2-细胞期到4-细胞期在有效地消耗丙酮酸和乳酸，而从8-细胞期以后丙酮酸和乳酸代谢开始降低，葡萄糖代谢提高并作为主要能源物质（图1）29-30o最近的研究进一步证明，培养液中的丙酮酸和乳酸不能提供给受精卵和胚胎碳离子合成瞟岭核苜酸酶，研究者认为，到胚胎自体基因激活表达为止，胚胎主要是依赖于卵母细胞在生长过程中蓄积的核苜酸来维持胚胎发育13,31-32。虽然早期的研究对胚胎体外培养液中存在的葡萄糖成分在胚胎自体基因激活和表达有所报道11,14,33-34,但是近期对糖代谢的研究表明，从受精卵到囊胚期胚胎发育过程中的细胞核糖
12、核甘酸的碳离子，尤其是囊胚期的胚胎碳离子全部来源于葡萄糖32。由此表明，胚胎体外培养液中的葡萄糖成分即使在受精卵和早期卵裂期胚胎发育过程中没有直接参与代谢被利用，但是培养液中的葡萄糖成分对受精卵分裂及胚胎自体基因激活和表达似乎没有抑制作用。受曲琳2细密期8细胞期真丛期注:早期研究认为,从受精卵（合子）到2-细胞期卵炎胚的培养发育需要在培养液中添加内胡酸.从2细胞期到8细胞期胚胎体外培养发育需要在培养液中添加乳酸,进而从8.细胞期到囊胚期的体外培养发育需要在培养液中添加前标结成分图1H期研究对受精卵到代胚期胚胎体外培养发育的能Irt代谢需要的认知和理解过程虽然胚胎体外培养液中添加的乳酸可以有效地
13、促使单细胞的受精卵分裂发育为2-细胞期卵裂胚，但研究表明，培养液添加中的乳酸需要由乳酸脱氢酶(IaCtatedehydrogenase,LDH)氧化转化为丙酮酸才能进入三竣酸循环来达到这一效果35。LDH的活性在受精卵至2-细胞期为最高，而在囊胚期为最低36。也就是说，从单细胞期的受精卵到2-细胞期卵裂胚需要由培养液成分中的丙酮酸代谢支持，然而乳酸需要由LDH将其转化为丙酮酸才可以被受精卵和2-细胞期卵裂胚所利用37胚胎体外培养液中添加的乳酸成分利用率由LDH控制，研究表明LDH的活性受胚胎内部烟酰胺腺瞟岭二核苜酸(nicotinamideadeninedinucleotidezNAD+NAD
14、H)浓度影响38由此可见，虽然从单细胞的受精卵到囊胚期能量代谢需求具有一定的差异，但是胚胎培养液中的葡萄糖、乳酸和丙酮酸之间可以有效地进行转化和被利用(图2)。为此有研究者提出的序贯式培养液可能并不一定适合于人类的受精卵到囊胚的体外发育培养16,25,39oNADH、/1.DHNANAOH注:ZGA东胚体映闪聚酒:TCA,*示McieNiHsNAIMI示烟Sl被隙嗦心H(甘酸h,U)示烟酸板服看”KffQLDH孔戴脱KIW5GAPDH示油Iff-IK脱氧IW:ATP示WMKfflAl)P4iJAMIKfF图2从受精卵则责胚IW胚脑络祢版中乳箧代谢可德发生的变化模式网三.胚胎体外培养液中添加的乳
15、酸和乳酸盐成分一般认为，肌肉代谢在缺氧的情况下，由糖酵解产生代谢产物乳酸，但是乳酸在有氧环境下可以有效地被利用40。乳酸的去除或消耗靠它的氧化完成，并且乳酸的氧化代谢主要在线粒体内进行41,然而，乳酸穿梭机制可能对胚胎着床前体外培养发育过程并不适用。为此有人指出，有关乳酸成分在胚胎体外培养液中从受精卵到囊胚期发育过程中的具体作用，可能与体内情况不大相同42。由早期研究显示，小鼠2-细胞期卵裂胚到囊胚期胚胎的培养液中乳酸的有效含量是10.15mmol/L11o然而进一步研究证明，体外发育培养液中同时含有（2.55.0）10-2mol/L乳酸和（2.55.0）10-4mol/L丙酮酸可以获得最佳囊
16、胚发育效果43。Whitten等7同时使用两种乳酸盐,即1.71mmol/L乳酸钙（L-Ca-Iactate）和21.58mmol/L乳酸钠（DL-乳酸钠）配制成胚胎体外发育培养液来促使小鼠2-细胞期到囊胚期胚胎发育44。而Brinster11,43所使用的是DL-乳酸钠配制胚胎体外培养液来促进小鼠-细胞期卵裂胚到囊胚期胚胎体外发育。乳酸分子结构中有一个不对称碳原子，形成旋光异构体，即右旋D-体,左旋L-体以及外消旋DL-体，共三种光学异构体。在人体及哺乳动物组织中存在右旋D-体及外消旋DL-体，而左旋L-体则为哺乳动物的正常代谢产物。虽然市售有右旋D-体和左旋L-体产品，但是由发酵法或合成法
17、制得的产品均为外消旋DL-体。由于在其分子中存在有羟基及竣基，所以乳酸具有这两种功能团的作用，与酸酊生成竣酸酯，与醇生成乳酸酯，与钠、钙、亚铁等离子可生成盐。因乳酸同时具有羟基和竣基，可以发生自酯化作用，生成线型聚酯，甚至可以生成环状化合物，即生成环状二聚物丙交酯。如上所述，在体外培养条件下氧化，乳酸可生成丙酮酸。同时乳酸可与氨或胺反应，可以生成乳酸酰胺。另外，由于乳酸同时具有羟基和竣基，除了可以发生自酯化外，羟基和竣基还可与醛或酮反应生成环状缩醛。最近，有研究者比较了15种商品化的胚胎体外培养液，其中两种培养液使用了DL-乳酸钠作为原料，为此认为培养液含有的DL-乳酸盐成分可能不被胚胎发育所
18、利用9。虽然目前商品化胚胎体外培养液都倾向于把DL-乳酸钠盐原料替换成L-乳酸盐成分，但缺乏试验证据。如前所述，由于右旋体D-乳酸和外消旋体DL-乳酸在结构上的差异，所以可能具有完全不同的生理作用。为此，外消旋体DL-乳酸或乳酸盐在配制的多种成分混合的复合培养液中，对受精卵到囊胚期胚胎发育过程中的详细作用，目前还不是很清楚，有待于今后的进一步研究确认。四.结论胚胎体外培养技术源于其他细胞和组织的体外培养技术。胚胎体外培养液的发展过程证明，不同胚胎发育时期需要不同的能量代谢物质。胚胎着床前发育到一定时期是靠卵母细胞在生长过程中蓄积的蛋白和mRNA支撑，然后开始激活胚胎自体基因表达进而支持发育成囊胚。虽然模拟体内稳态进行体外发育培养似乎重要，但是适应胚胎体外发育所需不可忽视。胚胎体外培养液中添加的乳酸成分是受精卵和胚胎发育过程中能量代谢所需物质，但是只有在乳酸转化为丙酮酸后才可以被受精卵和胚胎代谢所利用。右旋体D-乳酸和外消旋体DL-乳酸在结构上具有差异，所以在生理作用上可能完全不同。因此不能说用外消旋体DL-乳酸或乳酸盐配制的培养液对受精卵到囊胚期胚胎体外培养发育具有不良作用。
