饲料中粗蛋白的测定.ppt

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1、4.3 饲料中粗蛋白的测定,蛋白质是畜禽日粮中最主要的物质之一，蛋白质是生命的物质基础。测定饲料中蛋白质的含量，对于初步评价饲料的营养价值、合理开发利用饲料蛋白资源、提高产品质量、优化饲料配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。饲料中蛋白质的检测十分重要！,8/30/2023,一、蛋白质的测定方法,1直接法 根据蛋白质的物理、化学性质直接测定蛋白质含量。双缩脲法Folin酚试剂法（Lowry法）紫外吸收法（最常见的280nm）考马斯亮兰法（Bradford法）染料结合法,8/30/2023,一、蛋白质的测定方法,2间接法 通过测定样品中总含氮量推算蛋白质含量（根据：每种蛋白质的含氮

2、量是恒定的，N6.25）。凯氏定氮法（Kjeldahl）89小时杜马斯燃烧定氮法（Dumas Combustion Method）9001200高温燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的干扰成分被一系列适当的吸收剂所吸收，混合气体中的氮氧化物被全部还原成分子氮，随后氮的含量被热导检测器检测。35 分钟强碱直接蒸馏法 样品在强碱溶液中消煮，使蛋白质中的不稳定氮素以氨的形式释放出来，在 一定条件下，所释放的氨和样品中的含氮量成正比且有很好的相关性，建立 不稳定氮量与全氮量之间的回归方程。20分钟 纳氏试剂比色法,8/30/2023 8:15 PM,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,19世纪（1883）建

3、立的经典方法，结果可靠（最常用的标准方法），凯氏定氮法由于具有测定总有机氮量准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。但操作费时（89 h）改良方法：加催化剂加快分析速度、仪器改进（自动、半自动凯氏定氮仪）。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,1.原理 各种饲料的有机物质在还原性催化剂（如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉）的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（如氨基酸、酰胺、核酸，在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含

4、氮物质，则以CO2，H2O，SO2状态逸出。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,1.原理：使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮；：将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则 被还原成二氧化硫；2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。H2SO42NH3(NH4)2SO4,2NH2(CH)2COOH 13H2SO4(NH4)2SO4 6CO2 12SO2 16H2O,样品消化,浓硫酸具有脱水性,浓

5、硫酸具有氧化性,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,1.原理 消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的氨态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵。,蒸馏,2NaOH(NH4)2SO4 2NH3 Na2SO4 2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,1.原理 以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，根据标准酸的消耗量，即可计算有机氮的含量。而后，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白质的含量。,滴定,(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4

6、Cl+4H3BO3,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,凯氏定氮瓶（或消化管）及蒸馏装置硫酸铜硫酸钾硫酸2%硼酸溶液,40%氢氧化钠溶液0.2%甲基红0.2%溴甲酚绿0.2%甲基红及0.2%溴甲酚绿的1+5混合指示剂0.1mol/L的标准盐酸溶液(或1/2硫酸溶液),2.主要仪器及试剂,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.测定步骤 第一步 样品消化 称取适量样品0.51g（含氮量580mg），无损失（用滤纸包好）地放入干燥凯氏烧瓶或消化管中，加入0.2g硫酸铜（CuSO45H2O），3g无水硫酸钾（或无水硫酸钠）及10mL硫酸，轻轻摇匀后进行消化。（样品CuSO

7、45H2OK2SO4浓硫酸）透明蓝绿色,空白试验：取与处理样品相同量的硫酸铜，硫酸钾，硫酸按同一方法作试剂空白试验。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.测定步骤 第一步 样品消化 硫酸铜/无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）（1）K2SO4或Na2SO4的作用：提高溶液的沸点而加快有机物的分解；K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.测定步骤 第一步 样品消化 硫酸铜/无水硫酸钾（

8、或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）（2）CuSO4的作用 催化剂，加速氧化分解；2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。可以指示消化终点的到达；下一步蒸馏时作为碱性反应（加入碱量）的指示剂。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.测定步骤 第一步 样品消化注意事项：总氮测定时，消化至关重要。消化在通风橱中进行（若无通风橱.）。在消化开始时，应控制火力（应从低温开始分阶段升温至360410

9、），保持缓慢沸腾，避免试样溅于瓶壁，难于消化使氨损失。实验中要保证硫酸足量，否则过多的硫酸钾形成硫酸氢钾，而削弱了硫酸的消化作用。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.测定步骤 第二步 氨的蒸馏 样品分解液定容 试样消煮液令却，小心加20ml水，移人100ml容量瓶中，冷却后，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容置瓶中，再加水至刻度，作为试样分解液备用。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.测定步骤 第二步 氨的蒸馏 蒸馏 蒸汽发生器的准备：装好定氮装量，于水蒸气发生瓶内装蒸馏水至约23处，加甲基红指示液数滴及硫酸数滴，以保持水呈酸性（水为橙红色，否则补加硫酸，大

10、家想想为什么？）。加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。,防止水中氨态氮的逸失而影响测定值。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.测定步骤 第二步 氨的蒸馏 蒸馏 硼酸溶液的准备：向接收瓶内加入20mL2%硼酸及2滴混合指示剂并使冷凝管下端插入液面下。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.测定步骤 第二步 氨的蒸馏 蒸馏 开始蒸馏：吸取10.0mL样品消化稀释液注入凯氏定氮仪的反应室中，用10mL蒸馏水冲洗进样入口，再加10mL40%氢氧化钠溶液入反应室（动作要快，以防氨逸出），塞好入口玻璃塞，在入口处加水密封，防止漏气。打开水蒸

11、汽发生器与反应室之间的夹子，蒸汽通入反应室使氨气被蒸发出来，并通过冷凝管而进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸馏5min，使冷凝管离开吸收液面，在蒸馏1min，用水冲洗冷凝管末端，洗液流入接收瓶中，取下接收瓶。最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸！,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.测定步骤 第二步 氨的蒸馏注意事项：凯氏定氮蒸馏过程中，要求整套装置呈密闭状态，蒸馏前应检查定氮仪各导管间的连接处是否密闭，以免产生泄露；测定样品前应清洗蒸馏装置，即用蒸馏水空蒸一次或数次；蒸馏后立即清洗蒸馏器。蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由

12、于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。蒸馏时，火力稳定，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不得停火断汽，否则发生倒吸。加碱要足量（反应室液体呈深蓝色或褐色）并且碱液不能污染冷凝管及接收瓶。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.测定步骤 第三步 滴定用微量酸式滴定管，以0.1或0.02mol/L盐酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。空白试验：同时取10.0mL空白消化稀释液同上操作，以校正药品不纯所发生的误差。,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,4结果计算CP样品中蛋白质的含量（%）；V1样品消耗盐酸标准液的体积（mL）；V2空白实验消耗盐酸

13、标准液的体积（mL）；C盐酸标准溶液通过标定后的摩尔浓度（mol/L）；0.014每毫升盐酸标准液（1 mol/L）相当于氮的克数；m样品质量（g）；6.25氮换算为蛋白质的系数（换算系数）。（大家想想6.25是如何计算出来的？）,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,5.方法的评价凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官、各种饲料等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到较准确的结果，至今仍被作为标准检验方法。但此法灵敏度低，适用于0.2-1.0mg 氮，操作比较复杂，所需时间长。用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮

14、色素等非蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。,事件,8/30/2023,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,5.方法的评价不同的蛋白质其氨基酸组成及比例方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同（约在14.719.5，平均为16），因而不同蛋白质系数也不一样。,Tyr（酪氨酸）：分子量181.9，含氮量7.69；Ala（丙氨酸）：分子量89.1，含氮量15.7；Lys（赖氨酸）：分子量146.9，含氮量9.06。,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,（一）双缩脲法（Biuret法）1原理 双缩脲是两个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。NH2-CO

15、-NH2+NH2-CO-NH2 NH2-CO-NH-CO-NH2+NH3 在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。蛋白质及多肽含有两个以上的肽键（CONH），与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关。故可用来测定蛋白质含量。,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,（一）双缩脲法（Biuret法）1原理 在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540560nm下比

16、色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,（一）双缩脲法（Biuret法）2方法评价该法的优点是样品不需消化处理，结果为饲料中蛋白质的真实含量，操作简单，具有快速、准确等优点。但二肽含量不能测定（想想为什么？）。该法灵敏度低，测定蛋白质的浓度范围适于110mg/mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定，但并不需要十分精确的蛋白质测定。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。除-CO-NH-有此反应外，-CONH2-，-CH2-，N

17、H2-，-CS-CS-NH2，等基团亦有此反应。,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,（二）Folin-酚试剂法(Lowry法)1原理 此法的显色原理与双缩脲方法相同，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色，原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸或色氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,（二）Folin-酚试剂法(L

18、owry法)2方法评价本法的优点是操作简便、灵敏度高,定量范围为5100g蛋白质，较双缩脲法灵敏100倍。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。其不足之处是此反应受多种因素干扰。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。Folin酚试剂的配制较为困难（现在已可以订购）。,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,（三）紫外吸收法1原理 蛋白质分子中，酪氨酸

19、、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,（三）紫外吸收法2方法评价紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此

20、法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,（三）紫外吸收法2方法评价若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH

21、值，测定样品时的ph要与测定标准曲线的pH相一致。因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,（四）考马斯亮蓝染色法1原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反

22、应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。该法是1976年Bradford建立，因而又叫Bradford法。,（四）考马斯亮蓝染色法1原理,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,试剂配制简单，干扰物质少，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定浓度范围为01 000g/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。操作简便快捷，完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约

23、只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。,（四）考马斯亮蓝染色法2方法评价,8/30/2023,三、蛋白质含量测定的其它方法（直接法）,（四）考马斯亮蓝染色法2方法评价有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。,8/30/2023,相关事件,三鹿毒奶粉事件（2008）美国宠物饲料事件：“宠物毒粮”（2007）罪魁祸首：三聚氰胺（C3N6H6），“蛋白精”,纯白色单斜棱晶体，无味，微溶于水和热乙醇。含氮量66.6。,返回,8/30/2023,