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1、第六章 体外放射分析技术In vitro radioassay,山西医科大学第二临床医学院,体外分析发展史,Yalow,Berson,一、定义以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。,二、分类:,体外分析技术,体外放射分析,体外非放射分析,放射性竞争结合分析,放射性非竞争结合分析,放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA),免疫放射分析(immunoradiometric assay,IRMA),酶免疫分析(EIA)化学发光免疫分析(CLIA)荧光免疫分析(FIA),放射免疫分析
2、radioimmunoassay,RIA,一、RIA的基本原理（一）竞争抑制结合反应：放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原（*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞争抑制结合反应。,分析原理,*Ag+Ab,Ag,+,*Ag-Ab+*Ag,Ag-Ab+Ag,条件：*Ag与Ag免疫活性相同*Ag与Ab恒量*Ag与Ag总量大于Ab有效结合位点,Ag*与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争性与Ab结合，当Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*与Ag之和大于Ab时，则Ag*-Ab复合物的形成受Ag含量的制约，二者之间存在竟争抑制的函数关系，即随着Ag浓度的增加，Ag*-Ab复合物
3、就减少，因为Ag*对Ab的结合被Ag竞争性抑制。根据这一函数关系的标准曲线，可求出被测抗原的含量,（二）剂量反应曲线：标准曲线 标记物与被测物之间的函数关系可以用剂量反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准曲线。标准抗原(标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知剂量的非标记抗原。,标准曲线的绘制方法用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应；在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F；分别测量B和F的放射性；用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原对反应
4、变量的竞争抑制曲线，这就是剂量反应曲线。,标 准 曲 线,二、RIA的基本步骤：,实验由两部分组成：1.标准曲线：用一系列浓度递增的标准品（oAg），在 严格相同的条件下同*Ag竞争与Ab结合反应，以oAg的 剂量为横坐标，*Ag.Ab结合率（B%）为纵坐标制得 刻度曲线（Calibration curve）；2.样本测定：同等条件下，待测样本可获得一定的B%，由此可从标准曲线上求得待测物（oAg）的含量。,三、质量控制(Quality Control):,目的：为了获得准确可靠的测定结果 室间：某一地区/全国性机构就一些分析项目质控 对各实验室所得结果进行统计比较 室内：实验室内部对每次分析
5、结果的质量进 行检查和控制,误差：A.随机误差(Random Error)：放射性测量的统计误差 不可避免，呈高斯分 实验操作的实验误差 布，以精密度评价 试剂配制等 B.系统误差(Systematic Error)：通过努力可以 消除 由某一固定因素引起，仪器、试剂、操作程序、试验方法等,主要优点：,生物制剂，稳定性受多种因素影响，需有质量控 制措施（Quality Control),灵敏度高：可达10-910-12 g(mol),特异性强：抗原抗体结合具有很高的特异性,应用范围广：凡能制备相应抗体的生物活性物质，只要含量不低于RIA探测极限，都可建立,操作简便：所需试剂少，测量及数据处理易
6、于实 现自动化,主要缺点：,灵敏度很难超过10-15g水平,Thank You!,非竞争性放射免疫分析(免疫放射分析 IRMA),一.基本原理：,放射核素标记在抗体上，与待测抗原结合后，用一定手段将多余抗体除去，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原呈正相关,Ag+*Ab Ag.*Ab+*Ab(过量）(B)(F),IRMA与RIA的主要区别：,RIA IRMA,1.竞争性结合分析 非竞争性结合分析,2.三种主要反应试剂 两种主要反应试剂,3.标记抗原 标记抗体,4.复合物放射活度与 复合物放射活度与 待测抗原呈负相关 待测抗原呈正相关,5.NSB主要影响高剂 NSB主要影响低剂 量反应 量反应,
7、IRMA主要优点：,温育时间短：37温育23小时即可,灵敏度高：是RIA的10 100倍,测量范围宽：标准曲线工作范围宽,RIA 为2个 数量级，IRMA可达3个数量级,特异性强：应用针对某一抗原决定簇的单抗,不 易发生交叉反应,IRMA主要缺点：,需要二种McAb,抗体用量大,非放射标记的免疫分析法 化学发光分析 时间分辨荧光分析 酶免疫分析,电化学发光（ECL）：ECL是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫之后的新一代标记免疫测定技术 ECL是一种在电极表面由电化学引发的化学反应，实际上包括了电、化学发光两个过程，故是化学发光的一种发展，电化学反应在电极表面周而复始的进行，光信号明显
8、增强，因而ECL与CL的差异在于：,ECL是电启动发光反应，CL是通过化合物简单的混合启动的发光反应。ECL反应更易精确控制，更具灵活性。,ECL反应原理：化学发光反应导致光的发射是来自钌（Ru）化合物的电的激发，而不是化学的激发。,二.时间分辨荧光免疫（time-resolved fluorescence immunossay TRFIA）,稀土族中的镧系元素（Eu、Tb、Sm、Dy等）以离子价态时，受到紫外光或激光等激发后，会以荧光的形式发射光谱，其激发光光谱的波长和发射荧光的强度因离子不同而有差异，而且具有相当长的衰减时间，这样就为时间分辨荧光(TRF)所发射的信号采集和多标记的应用提供
9、了条件。,TRFIA是一种以镧系元素螯合物标记抗体或抗原，利用时间分辨荧光光度计测量法排除检品中非特异性荧光干扰的测量技术。,铕：（Eueuropium）铽：（Tbterbium）钐：（Smsamarium）镝：（Dydysprosium）,原理：TRFIA的标记物由镧系元素螯合物与Ab或Ag组成。待测物通过免疫反应形成的复合物上，标有镧系元素（Eu3+），经紫外线激发后会发出荧光。但连接在复合物上的Eu发射的荧光很弱，需要将其游离出来再形成一个能发射强荧光的络合物。因此在免疫反应结束后，需向体系中加入一种“荧光增强剂”，大大增加信号，所以该技术有时也称为解离增强镧系荧光免疫分析（DELFIA）。所谓时间分辨是指Eu3+受激活后产生寿命较长的荧光，而一般干扰荧光寿命较短，固可用仪器把测量时间定在每次激发后的数百s之后才开始，干扰荧光已衰减到很低水平，所取荧光信号是荧光衰减过程的中间一段。,螯合剂：异硫氰酸苯基-EDTA（ICB-EDTA）、对异硫氰酸苯 基-二乙基三氨基四乙酸（p-ICB-DTTA）增强剂：-萘酰三氟丙酮（-NTA）,几种免疫法检测血清中甲状腺素的精度：,
