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1、细胞工程,云南大学生命科学学院林洁 主讲,组成人及哺乳类动物机体的细胞具有极其复杂的结构和功能，细胞在机体内生长时相互依赖、相互制约，在神经体液的调节下形成了一种天然的内环境，体外生长时脱离了这些内平衡系统，与机体内细胞相比不完全相同。细胞体外生长时，有其特有的生长类型、特点、过程和所需的生长条件。,第三章 动物细胞培养的生物学知识,第一节 体外培养细胞的生长方式及类型第二节 体外培养细胞的生长特点第三节 体外培养细胞的生长和增殖过程第四节 体外培养细胞的生长条件第五节 体外培养细胞生长的监测方法,第一节 体外培养细胞的生长方式和类型,体外培养的动物细胞，按照其生长方式可以分为：1.贴壁生长型
2、细胞（贴壁型细胞）2.悬浮生长型细胞（悬浮型细胞）,1.贴壁生长型细胞,贴壁生长是大多数由机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。贴壁有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质结合。动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞必须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满表面。而从生长表面脱落进入液体的细胞通常不再生长而逐渐退化，这种细胞培养称为单层附壁培养。贴壁生长型细胞的生长一般都经历游离期、吸附期、繁殖期和退化期。贴壁培养的细胞可用以蛋白酶、酸、碱等试剂或机械方法处理，使之从生长表面上脱落下来。,1.贴壁生长型细
3、胞,在体外，细胞的贴壁方式与体内也不相同，体外培养细胞需要附着于某些带适量正电荷的固体或半固体表面，大多是只附着一个平面，因而体外培养的细胞的外形一般与在体内时明显不同。按照贴壁型细胞的体外培养时的形态，主要分为四大类：成纤维细胞型细胞上皮型细胞游走型细胞多形型细胞,此型细胞外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规则形。起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为这种形式。人胚肺细胞在显微镜下观可观察到典型的成纤维细胞型。,成纤维细胞型细胞,此型细胞形状上类似上皮细胞，扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则偏平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。起源于内胚层
4、与外胚层的细胞在体外培养时都可能呈现上皮型。血管内皮细胞、Hela宫颈癌细胞在显微镜下可呈现典型的上皮细胞型。,上皮型细胞,此型细胞具有类似巨噬细胞样的特征：在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；细胞胞质常伸出伪足和突起；在培养皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。表现此类细胞形态的主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞和肿瘤细胞。,游走型细胞,此型细胞形态上不规则，一般分为胞体和胞突两部分，其中胞突为细长形，类似丝状伪足；胞体虽然也略呈多角形，但没有成纤维细胞那样不规则。此类细胞不常见，只有某些神经组织细胞等那以确定其稳定
5、形态的才归入多形细胞。,多形型细胞,上述四种细胞形态学形式是细胞体外培养最常见的、也是形态最明显的几种形式，体外培养时所谓的某型细胞，仅是因为其形态与体内的某种细胞类似，而不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同，同时也不能说明培养细胞的起源。在实际培养中，所培养的细胞并不一定呈现某一种典型的形态形式，而多呈现的是一些过渡性形态。体外培养细胞的形态学特征受到多种培养条件的影响，因此，细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的一种参考性指标，不能用于确定某一培养物的确切细胞类型。,重要提示,2.悬浮生长型细胞,此类细胞在体外生长时可在培养基中悬浮生长，不必贴壁，因此也叫非贴壁型细胞。悬浮培养
6、类似微生物的深层培养。由于是悬浮生长，细胞密度一般都较高，培养的效率也高、操作也容易，易于大规模生产，便于过程的控制；大规模培养可采用培养微生物细胞用的发酵罐，但须将其稍加改进，如将搅拌速度减慢，搅拌叶改用螺旋桨式、通气装置通过硅橡胶管扩散的方式等。一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞，当接种于体外环境中，也可以以悬浮状态生长，这类细胞的胞体始终为球形。还有一些细胞，在体外培养时，即可贴壁生长，也可悬浮生长。,第二节 体外培养细胞的生长特点,体外培养细胞重要的生长特点包括：1.贴附与伸展2.运动的接触抑制和生长的密度抑制,1.贴附与伸展,贴附并伸展是大多数体外培养细胞的基本生长特点，大多数的哺
7、乳动物细胞在体外均附着于一定的底物而生长。当培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等在体外，细胞贴附的底物可以是其它细胞、胶原、玻璃或塑料等。一些促细胞附着因子（例如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、血清扩展因子、III型胶原等）可以促进细胞与底物的附着。一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长时期在悬浮中生长，除非是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。细胞的贴附与伸展受到离子的作用、机械和物理因素以及生物因素的影响。,细胞贴附与伸展的步骤,2.运动的接触抑制与生长的密度抑制,接触抑制是体外培养中多数贴壁型细胞的生长特性
8、之一。一般情况下，正常细胞在不断分裂而增殖的过程中存在不停顿的活动或移动，其外周的细胞膜呈现一些特征性皱褶样活动，但是，当两个细胞移动而互相靠近时，其中之一或两个将停止移动并向另一方向离开，这保证了细胞将不会重叠。当贴壁细胞长满底物时，一个细胞被其他细胞围绕致无处可去而发生接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜皱褶样活动将停止，此即接触抑制。,2.运动的接触抑制与生长的密度抑制,一般来说，当细胞生长、汇合形成单层时，细胞变得比较拥挤，扁平形成的程度减小，与培养液接触的表面积减少；同时培养液中的一些营养物将逐渐消耗掉，尤其是细胞周围的部位，因此，这种形成的单层细胞，其分裂将停止，单层细胞的密度
9、常与培养液中的血清浓度有关，这种贴壁细胞的体外生长特性被称为细胞生长的密度抑制（或密度依赖性调节）形成密度抑制的单层细胞可在静止状态维持存活一段时间，但不发生分裂增殖。转化细胞和恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，它们的密度依赖性调节常常降低，因而可以生长成较高的终末细胞密度,第三节 体外培养细胞的生长过程,体外培养细胞的生长过程包括三个层次的概念：1.细胞生长的全生命过程2.每代细胞的生长过程3.单个细胞的生长过程（细胞周期）,1.细胞生长的全生命过程,培养的细胞是生长在培养器皿之中的，当细胞持续生长繁殖一段时间后，到达一定的细胞密度之后，就应当将细胞分离成两部分或更多部分至新的培养器皿并补充更新培
10、养液，这一过程称为传代或再培养。从动物体取出的原代培养的原代细胞，经过传代以后，便成为了细胞系，一般正常细胞的这种细胞系的寿命只能维持一定的时间期限（被称为有限细胞系），然后将自行停止生长，即使提供足够的营养，最终仍致死亡，这个完整的过程，被称为细胞生长的全生命过程，也叫细胞系的生长过程。细胞系在培养中能够存活时间的长短，主要取决于细胞来自何种动物种族。在一些情况下，培养的条件也会在一定程度上影响细胞系的寿命。,1.细胞生长的全生命过程,在进行正常细胞培养时，无论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞的全生长过程中大致都要经过三个主要阶段：,原代培养或初代培养期 自体内取出在体外培养和第一次传代的
11、时期，一般约14周。与体内相应的细胞性状相似。传代期 传代大约数天至1周左右重复一次，持续数月，此期间细胞增殖旺盛。衰退（老）期 反复传代一定时间后（大概30至50代后），细胞增殖变慢，端粒进行性缩短，直至停止分裂。有的细胞的极少部分后来细胞能够转化，获得永生，成为无限细胞系。,细胞系原代细胞经第一次传代后形成的能够继续进行传代培养的细胞群体称为细胞系，一般为有限细胞系。原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。细胞株从一个经生物学鉴定的细胞系经过克隆化或其他筛选方法获得的单一类型的细胞群体被称为细胞株。,重要概念：细胞系与细胞
12、株,2.每代细胞的生长过程,在体外培养的细胞的生长过程中，当细胞繁殖到一定密度后，将之分开并转移至新的培养皿中的（称之为接种），使之继续繁殖生长，即为传代。细胞自接种至新的培养皿中至其下一次再传代接种的时间称为细胞的一代，每代细胞的生长过程可分为四个阶段：I.滞留期（2496h）II.指数生长期（35天）III.平台期（传代时机）IV.衰亡期,第四节 体外培养细胞的生长条件,体外培养的细胞需要合适的生长环境和必需的条件才能生存、繁殖。1.无污染环境2.温度3.pH4.气体环境5.渗透压6.营养7.生长附着物8.抑制物,1.无污染环境,在细胞培养过程中，离体细胞对任何毒性物质都非常敏感。因此，培
13、养环境的无污染是保证细胞生存的首要条件，培养环境的无污染主要包括：无毒性物质污染、无微生物污染和无其他细胞污染。保证无污染的措施有：所有培养材料、器具要严格按照一定程序严格清洗，绝对保证无毒和洁净，使用前必须进行消毒处理；细胞培养过程中所需的气体、液体，均应去除细菌、病毒和支原体等各类污染物；所有操作过程都必须在洁净条件下进行。,2.温度,维持细胞增殖生长，必须有适宜的温度。人和哺乳动物培养细胞的标准温度为36.5 0.5，若偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。总的说来，培养细胞对低温的耐受力比对高温强。高温会使细胞内酶失活并破坏细胞膜上的脂类结构，诱导细胞凋亡。温度不超过3
14、9 时，细胞代谢强度与温度成正比；超过41 时，细胞受损；超过43 时，细胞死亡。低温会降低细胞内酶的活性，对细胞伤害不大；温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。但如果向培养液中加一定量的保护剂（如DMSO、甘油），改变冰晶的性质，装入冻存管保存于液氮（温度可达-196）中，能长期贮存，细胞解冻复苏后，仍能继续增殖生长，细胞的生物学性状不受任何影响，这是保存细胞的最主要手段。,3.pH,合适的pH也是细胞生存的必要条件之一，不同细胞对pH的要求不同，哺乳动物细胞一般为7.27.4之间。一般来说，原代细胞对pH变动的耐受差，而传代细胞或肿瘤细胞对pH变动的耐受较强。当pH超出合适的范围
15、，如低于6或高于7.6都会对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞蜕变或死亡。一般来说，细胞对碱性不如对酸性的变化耐受。为保持培养环境的适宜的pH条件，可采用的措施：在培养液中加入缓冲剂以稳定培养液的pH；在开放式培养环境中，通入约5%的CO2，平衡培养过程中的CO2流失。,4.气体环境,气体是细胞生存的必须条件之一，其主要包括O2和CO2。O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。不同的细胞和同一细胞的不同生长时期，对氧的需求各不相同。细胞培养环境中的溶氧要适度，溶氧过低会影响细胞的能力代谢，从而影响细胞的生长；反之，溶氧过高是也会对细胞产生毒性，影响细胞的能量代谢。在
16、动物细胞培养过程中溶解氧一般控制在5%80%。CO2可以参与调节维持培养环境的pH。,5.渗透压,渗透压对动物细胞也有影响。多数传代细胞，对渗透压有较强的耐受性，而原代细胞和正常二倍体细胞对渗透压波动则比较敏感。人血浆渗透压约290mOsm/kg，为体外培养动物细胞的理想渗透压。不同细胞要求的渗透压略有不同，对大多数动物细胞来说，渗透压在260320mOsm/kg的范围内是较为适宜的。常用的渗透压保护剂有：三甲基甘氨酸、脯氨酸和甘氨酸-甜菜碱等。,6.营养,动物细胞的体外培养对营养的要求较高，往往需要多种营养成分的优化组合：氨基酸 所有动物细胞都需要12种基本氨基酸（精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、
17、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸）和谷氨酰胺。碳水化合物（糖类）糖是细胞物质构成碳架的来源，并且能够为细胞生长代谢提供所需的能量。葡萄糖利用率最高。维生素 是维持细胞生长的生物活性物质，其中烟酰胺、叶酸、核黄素、维生素B12、泛酸、吡哆醇及维生素C是必不可少的。微量元素 细胞体外培养除需钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如铁、锌、硒等。生长因子 包括激素类物质和促生长因子，胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、神经生长因子、血小板生长因子、内皮细胞生长因子、生长调节素等。,7.附着物,除少数悬浮型细胞外，绝大多数体外培养细胞需附着在适宜的附着
18、物上方能生长。原则上讲，凡对细胞无毒性的物质都可用作附着物。现今，常用的细胞培养附着物有：玻璃 是最常用的附着物，有透明、便于观察、易洗涤和能反复使用等优点，缺点是易破碎。一次性塑料 种类很多，常用有聚苯乙烯，具有疏水性，制成的培养瓶皿光洁平坦，且经加工处理后其表面带有电荷，产生疏水性，有利于细胞生长。微载体 是由聚苯乙烯、葡聚糖和聚丙烯酰胺制成的直径为100至300微米的小球体，细胞贴附表面积大，能够融合贴壁培养和悬浮培养的特点。,8.抑制物,当细胞的体外培养时，由于缺乏体内的调节机制，会造成代谢副产物的积累，从而抑制细胞的功能，最终导致细胞死亡。动物细胞培养过程中产生的抑制物主要有：乳酸
19、可以螯合钙离子，抑制谷氨酰胺酶，增加培养液的渗透压，并使pH下降。氨 能穿透细胞膜进入细胞内部，改变微环境的pH，刺激糖酵解，使葡萄糖消耗率和乳酸生成速率增加，抑制细胞呼吸。CO2 在培养液中过度积累会使pH下降，同时也会对细胞产生毒性作用。,第五节 体外培养细胞的监测（常规性检查）,细胞按种或传代以后，在生存期间，实验者每天或至多间隔1-2d，要对细胞做常规性检查。随时掌握细胞动态变化，以便做换液或传代处理；如发现异常情况应及时采取措施。体外培养细胞的常规性检查的目的是：考察三个问题污染与否？pH环境是否适宜？细胞的生长状态如何？,第四节 体外培养细胞的监测（常规性检查）,为达到体外培养的常
20、规性检查目的，可采用的检查方法有：1.微生物污染监测2.培养液观察3.细胞形态观察4.细胞计数5.细胞活性检测,1.微生物污染,在长时间多量培养工作中，即使用品消毒彻底，操作严密，亦难避免偶而发生污染。污染主要来于培养用液、培养基、血清或操作时由空气播散所致。最常发生的是霉菌和细菌污染。霉菌污染易于发现，如培养液中长出了各种菌落，肉眼可见，不难确认。细菌感染时，有的引起培养液混浊，镜下可见大量细菌，有的培养液无明显改变如怀疑污染，必要时可向肉汤或琼脂培养基里滴少量培养物，置37温箱培养数日，观察有无菌落形成，以验证是否污染。经常发生和难以发现的是支原体污染。PPLO体积小，只有0.25 1 m
21、大小，且无细胞壁。PPLO污染后的细胞仍然能生存，甚至无明显变化，有时导致培养细胞发生不同程度的病理改变。,2.培养液观察,在正常情况下，培养液呈桃红色。用一般恒温箱培养时，随细胞生长时间延长，二氧化碳（CO2）积累增多，在超出缓冲范围后，营养液酸化变黄，此时如不调节pH，对细胞会发生不利影响，严重时细胞脱落死亡。营养液碱化变红除因瓶口不严二氧化碳（CO2）溢出外，也可能由于培养瓶和瓶塞刷洗不洁，残留碱性物质所致。更换营养液的时间，可依营养物的消耗而定，细胞生长旺盛时2-3d换一次，生长缓慢时3-4d亦可。,3.细胞形态检查,生长状态良好的细胞在一般显微镜下观察时透明度大，轮廓不清，只有用相差
22、显微镜，才能看清细胞的细微形态。细胞机能不良时轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其它颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态常变得不规则和失去原有特点，如上皮细胞会变成纤维细胞等。,4.细胞计数,用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法。常用的技术方法有两种：用血细胞计数板人工计数，是最经济的方法；用细胞计数器，比较昂贵。血细胞计数板：有不同的型号，常用的是改良的纽巴氏血细胞计数板。纽巴氏血细胞计数板有两个计算室，各室划分为9个大格，每个大格的平均面积为1mm2。计算室上方盖上血细胞计数板专用的盖玻片后，室的深度则为1/10 mm。在计算室四角的4个大方格又各划分为16个中方格。计算
23、室中央的一大格，用双线划分为25个中方格。每个中方格内又划分为16个小方格。用于血细胞计数时，白细胞用四角的4个大格，红细胞用中央的1个大格。,用血细胞计数板进行细胞计数的步骤,S1准备计数板:用无水酒精或95%酒精清洁计数板及专用盖玻片将，让后用绸布轻轻擦拭，并盖玻片放于计算室上。S2制备细胞悬液:用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮细胞，制成单细胞悬液，一般要求细胞密度不低于104/ml。S3加样:用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，也不要过少或带气泡。S4计数:在显微镜下，用低倍镜观察对焦距找到划格
24、线区域。对好焦距进行细胞计数，计中央大方格内的细胞，可依中方格顺序计数中方格内的细胞数，避免计数重复或漏计。细胞压线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。,用血细胞计数板进行细胞计数的步骤,按照计算公式计算细胞数中央大方格的面积为1mm2，室深为0.1mm，则体积为0.1mm3。一般以每毫升含细胞数来表示，推算得0.1mm3l04才为1 ml体积。所以计算公式为：红细胞计数：细胞数/每毫升原液=5个中格细胞数之和 5104稀释倍数白细胞计数：细胞数/每毫升原液=（4个中格细胞数之和/4）104稀释倍数注意事项消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液；取样前，应充分混匀细胞悬液；镜下计
25、数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，如细胞团占10%以上，说明消化不充分应重新制备细胞悬液；镜下技术时，若细胞数少于20个/10mm2或多于500个/10mm2，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液；每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。,5.细胞活性监测,可用对色素的吸附性来判断细胞的死活。用活细胞占计数细胞中的百分比表示其活力。常用方法有I.染色排除法（即死细胞着色）II.活细胞着色法,I.染色排除法,1、台盼蓝 称0.4g台盼蓝，溶于100mL的Hanks液，调节pH至，配制时可加热使其充分溶解。按细胞悬液和染液9：1比例混合后，4min计数，若时间过长，活细胞亦可受损而着色。死细胞被染成蓝色。2、苯胺黑 0.05%苯胺黑（溶于Hanks液），用细胞悬液作10倍稀释，稍放置后镜检。苯胺黑对细胞毒性小，但溶解性较差，最好过滤一下。黑色细胞为死细胞。3、藻红 把细胞悬浮于0.02藻红B（溶于Hanks液），2h内镜捡，死细胞可着色。这种色素易同蛋白质结合，故须把血清洗净。,结晶紫，细胞悬液同0.1结晶紫（溶于Hanks液）混合后，立即镜检，着色的为活细胞。,II.活细胞染色法,
