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1、FLOW CYTOMETRY,流式细胞技术,流式细胞术,流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。原理：以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞(微粒)的性状进行定性、定量分析和分选。,流式细胞仪简介,流式细胞仪（Flow Cytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式细胞仪特点,单细胞悬液或生物颗粒,分析
2、速度高,多参数,精度高,当代最先进的细胞定量分析技术,流式细胞仪的分类,分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选，不兼单纯分析。,BD公司产品 FACS Calibur,特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光细胞分选速度慢，主要用于细胞分析,台式机 双激光四色，市场覆盖率最高,FACSAria,科研型分选流式细胞仪,特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选
3、和多色分析,FACS Vantage DiVa,科研型（大型机）,特点：多数字化适用用各类细胞分选4路分选,Beckman Coulter流式细胞仪,Epics XL 单激光四色，市场覆盖率高，分析型,CyAn三激光九色，分析型,FC 500 单激光或双激光五色，市场覆盖率高，分析型,Gallios 三激光十色，分析型,MoFlo XDP 高端分选型,第一节 流式细胞仪结构组成,液流系统光学系统电子数据系统细胞分选系统,液流系统,液流系统,鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。流体动力学聚焦：稳定的液流从截
4、面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。,鞘液,鞘液,细胞流,激光照射点,流体动力学聚焦示意图,液流驱动系统,进样速率控制,通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。,光学系统,激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。,光学原理,散射信号与荧光信号,荧光信号,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。,发射波长(荧光波长)Emissio
5、n wavelength,激发波长Excitation wavelength,电子数据系统,电子数据系统构成：,光电检测器将光信号转换成电子信号。前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。数据处理系统计算机系统数据采集、分析。,光电检测器(photodetector),光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（FSC）；光电倍增管(photomultiplier,PMT)光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。,光信号的类型：散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。前向散射光(forward sc
6、atter,FSC);侧向散射光(side scatter,SSC).荧光信号自发荧光：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。,流式细胞分析的信息光信号检测,流式细胞的基本信息:“形态”,散射光的作用,实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。,粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,红细胞、死细胞和碎片,流式细胞的主要信息:Fluorescence,FL1FL2FL3FL4,最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合,Forward scatter(FSC)Side scatter(SSC)FL1-绿色FL2-
7、黄色、橙色FL3-红色FL4-红色,流式常见图形(Histogram Plot),适用于：单参数分析,DNA倍体分析,抗原表达分析,流式常见图形(Dot Plot),散点图,伪彩图,假三维图和三维图,等高图和密度图,等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。,设门与数据分析,门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。,椭圆形,圆形,十字门,线性门,流式分选,电荷式分选超声振动器(15-100kHz)液流充电系统高压偏转板收集装置(流式管
8、、培养板),lasers,断裂点(充电),高压偏转板,第二节 流式细胞术的科研应用,分析群体细胞所需时间短多参数分析定性或定量,流式应用常见范围,细胞大小细胞的颗粒度细胞表面分子：CD 系列等细胞浆内分子：胞内细胞因子等细胞核内分子：P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡、PH、Ca+、细胞活性等,样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋,单细胞 悬液,标记荧光抗体,检测,表型测定,细胞分选,流式细胞术操作流程,统计学 分析,继续培养,实验标本的处理,单细胞悬液的制备：胰酶消化抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体,细胞染色,染色要求：特异识别某一群细胞，有效区分
9、不同细胞亚群非特异反应水平低抗体效价高，用量适用于常规标本使用特异的单克隆抗体最好使用荧光直接标记的抗体采用适当的阴性对照物抗体最适滴度,抗体的选择,首选直接标记抗体荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原间接标记：适用范围广,biotin-avidin不适 合弱抗原的检测,实验对照的设计,空白对照：ALL阴性对照：评估非特异反应水平，界定阴性范围 常用同型抗体对照 单色分析：设阴性对照（或同型抗体对照）多色分析：阴性对照（或同型对照），单阳性对照（用于仪器校正），补偿调整管阳性对照：确定抗原表达正常时的抗原表达强度和百分含量。（特别在检测阴性时）,流式检测应用实
10、例,细胞表面、细胞内分子检测细胞周期分析细胞凋亡分析,淋巴细胞表面抗原分析,样本来源新鲜抗凝全血PBMC单克隆荧光抗体染色溶血洗细胞固定上机检测,淋巴细胞细胞内抗原分析,样本来源新鲜抗凝全血PBMC细胞表面抗体染色溶血、固定细胞打孔细胞内抗体染色上机检测,细胞周期分析：,G1,M,G2,S,Quiescent cells,G0,处于不同细胞周期的细胞DNA含量不同，G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA，G2/M期细胞含有四倍体量的DNA，而S期细胞DNA含量处于二倍体和四倍体量之间。DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度反应了DNA吸收荧光分子的多少。
11、通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量，区分细胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例。,样品制备,1000rpm 5分钟收集2X106个细胞,PBS漂洗 两次,70%酒精4度固定过夜,收集固定的细胞,PBS漂洗,PBS悬浮细胞,2.5l 10g/l RNase A,37消化1小时,过300目细胞筛,50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton)，,1000rpm5分钟 离心,两次,混匀，室温静止5分钟,上机,DNA 流式检测的主要指标,DNA 含量:ploidy：细胞内染色体DNA含量 DI：测定标本的G0/G1期细胞DNA含量与同种系正常细 胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值
12、，表示细胞倍体性PI：增殖细胞占总周期细胞的比例CV：G0/G1期细胞DNA含量变异系数,Annexin V Assay（建议用于悬浮细胞）,在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。在Ca2+存在时，Annexin V 与PS 有很高的亲和力，可与之迅速结合。PS 外翻发生在细胞核破裂、DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。PI 被用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。坏死细胞可以同时与annexin V-FITC 和PI 结合显色，而PI 则被排除在活细胞(FITC 阴性)和早期凋亡细胞(FITC 阳性)之外。,Annexin V-FITC/PI双染色法,双阴：活细胞 Annexin V-FITC单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 PI 单阳：坏死细胞,PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以PI不能进入早期凋亡细胞核内。,Annexin V-FITC,PI,活细胞,早期凋亡,晚期凋亡坏死细胞,裸核,
