环境毒理学(董国日)05-1环境毒理学常用实验方法.ppt

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1、第五章 环境毒理学常用实验方法,第一节 急性毒性实验 第二节 蓄积毒性实验第三节 亚慢性和慢性毒性实验第四节 致突变试验第五节 致畸试验第六节 致癌试验,研究方法 流行病学研究 受控的临床研究 毒理学体内试验 毒理学体外试验优点 真实的暴露条件 规定的限定暴露条 易于控制暴露条件 影响因素少，易于控 在各化学物之间发生相 在人群中测定反应 能测定多种效应 制 互作用 对某组人群(如哮喘)能评价宿主特征的作用 可进行某些深入的研 测定在人群的作用 的研究是有力的(如：性别、年龄、遗 究(如：机制，代谢)表示全部的人敏感性 能测定效应的强度 传特征等和其他调控因 人力物力花费较少 素饮食等)能评价

2、机制缺点 耗资、耗时多 耗资多 动物暴露与人暴露相关 不能全面反映毒作用 多为回顾性，无健康 较低浓度和较短时 的不确定性 不能作为毒性评价和 保护 间的暴露 受控的饲养条件与人的 危险性评价的最后依 难以确定暴露，有混杂 限于较少量的人群 实际情况不一致 据 暴露问题(一般50)暴露的浓度和时间的模 难以观察慢性毒作用 可检测的危险性增加必 限于暂时、微小、式显著地不同于人群的 需达到2倍以上 可逆的效应 暴露 测定指标较粗(发病率，一般不适于研究最 死亡率)敏感的人群,毒理学研究方法的优缺点,1 实验动物和人对外源化学物的反应敏感 性不同，有时甚至存在着质的差别2 高剂量向低剂量外推的不确

3、定性3 小数量实验动物到大量人群外推的不确 定性4 成年健康动物向年老体弱及患病个体外 推的不确定性,实验动物的毒理学实验资料外推到人群接触的安全性时的不确定性,1 化学物在实验动物产生的作用，可以外推 于人。基本假设 人是最敏感的动物物 种；人和实验动物的生物学过程与体重(或体表面积)相关。2 实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对 人潜在危害的必需的和可靠的方法。3 成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物和 人可能的暴露途径是基本的选择。,描述毒理学试验的基本原则,1 受试物毒作用的表现和性质 2 剂量反应(效应)研究 3 确定毒作用的靶器官 4 确定损害的可逆性,毒理学毒性评价试验的基本目的

4、,实验动物（laboratory animal）指经人工培育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确，来源清楚，可用于科学研究的动物。,实验动物的选择,实验动物的选择,物种选择 1 选择对外液化学物的毒性反应及代谢特点与人类接近的物种；2 选择自然寿命不太长的物种；3 选择易于饲养和实验操作的物种；4 选择经济并易于获得的物种。,近交系动物 连续20代以上兄妹交配或亲子交配培育突变系动物 突变的基因可世代相传并保持遗传基因特性杂交群动物 两个不同近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物，亦称杂交一代动物。封闭群动物 5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所保存繁殖的动物群,实

5、验动物的选择,品系选择,无菌动物 体内外均无任何微生物和寄生虫无特定病原体动物（SPF）体内无特定微生物和寄生虫存在的动物(无传染病)。饲养于封闭的系统。清洁动物 与SPF的不同：抗体检查常有脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗体滴度，但不应有临床症状、病理改变及自然死亡。饲养在半屏蔽系统。,微生物控制的选择,实验动物的选择,个体选择 1 年龄2 性别 3 生理状态 4 健康状况,实验动物的选择,品 系周龄 Wistar SD雌性雄性雌性雄性 354565052 4919786101 5134134130150 6166187172206 7209233210262 8214297240318 923

6、232525836510246370272399,大鼠体重与周龄的关系,小鼠体重与周龄的关系 品 系 周龄 昆明 BALB/c C57BL/6 615 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 01.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 15.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 27.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96 313.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 421.35 22.6011.6012.4512.2012.5715

7、.7519.00 527.90 33.2514.7516.1016.9018.1020.7522.58 632.80 39.2515.6017.4018.4020.5021.8825.96 734.70 39.9016.1018.6519.0021.6023.1227.96 834.80 40.0518.1620.2520.2522.4024.1628.83,1 未处理对照组(空白对照组)：本底值，质量控制2 阴性(溶剂赋形剂)对照：与染毒组比 较的基础 3 阳性对照：检测试验体系的有效性4 历史性对照：检查试验体系的稳定性，即进行实验室质量控制和保证,毒理学试验常用对照,对各个毒理学试验应该

8、用同一种、同一批号受 试物 受试物成分和配方必须固定 如是异构体混合物，异构体比例必须固定 活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度也 应固定 受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性 必须进行研究并报告 受试物应一次备齐全部实验的用量,受试样品,毒理学试验设计的统计学要求 随机、重复、对照原则 对常规毒理学试验资料的统计学方法 计量资料：一般用t检验或ANOVA 记数资料：卡方检验,毒理学试验的统计学,1 处理组与对照组比较差别有无显著性 2 有无剂量-反应关系3 是否伴有其他相关参数的改变4 是否在“正常”值范围,实验结果的判断,第一节 急性毒性试验一、急性毒性试验的目的：1、确定供试化学物

9、急性毒性的剂量反应关系和中毒特征；2、求LD50或LC50,为急性毒性评价提供依据。3、研究毒物的毒动学和毒效学过程。,表示急性毒性大小：LD50(对受试物的个体感受性影响较小，有更高的重现性),二、试验程序与评价 1动物选择：首选受试物在体内代谢情况与人体内相近的或对受试物最敏感的品系。一般：以哺乳动物为主，常用大鼠、小鼠；经皮：兔、豚鼠、猪 应对两种性别、成年和幼年动物进行测定。选择两种以上的实验动物，最好一为啮齿类，一为非啮齿类。(目的：核对种间差异),2染毒途径与方式：一般与人的接触途径相同。(1)经口染毒：常用灌胃法，也可将受试物放在饮水中由动物自由摄取。(2)经呼吸道染毒：将实验动

10、物放在有毒气或粉尘的染毒柜内进行染毒。急性吸入染毒采用静式染毒瓶(柜)，染毒24h。(3)经皮肤染毒：主要用于化学物经皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。正式给药前24h，背部脱毛，勿伤皮肤。将受试物均匀涂布于皮肤表面，用纱布覆盖，共敷24h。,3试验程序：（1）剂量与分组 预试验：找出受试物大致致死量范围(死亡率为10%90%)；例：欲做化合物A的经口预试验。化合物B的化学结构与A相似，已知B的=LD50=40(预期毒性中值)。则预试验取2.5、10、40、160、640(上下各推12组，组距应较大，初始4倍差),求LD50正式试验：在LD100与LD0之间设57个剂量组。组距(对数)或 式中

11、：n-设计的剂量组数（2）症状观察 时间：24h或两周内的反应,三、LD50的计算与结果评价 计算方法：概率单位法和寇氏法。LD50值愈小，毒性愈大。,概率单位法,存在正态曲线关系。标准正态差d=(x-)/式中：x剂量对数；剂量对数均数 标准差,d=0，左边面积(死亡率)为50，右边面积(存活率)50 d=1，死亡率为84.13，d=2，死亡率为97.73,d2，死亡率接近100。d=一1，死亡率为15.87。d=一2，死亡率为2.27。d一3，死亡率接近0。,从上表，可以任一死亡率换算为相应的概率单位。,A：剂量对数死亡百分率B：剂量对数概率单位,LC50计算步骤如下：a.根据死亡率查概率单

12、位(死亡率为100或0不计)b.绘图求回归方程。c.求y=5的浓度对数（m），其反对数即为LC50,同理可得LC5、LC10、,d.求LC50的可信限 先求LC50的标准误差(Sm)：S(校准差)=1/k 本例中：S=1/2.78,平均致死量法（又名寇氏法）,试验要求：每个试验组动物数相同；各组剂量按等比级数分组；最大剂量的死亡率最好为100或与之接近，最小剂量的死亡率最好为0或与之接近。,式中：Xm最大剂量的对数值；i相邻剂量比值的对数；各组死亡率的总和（以小数表示）。,例小鼠腹腔注射致百虫急性毒性试验结果如下表所示，求 LD50,式中：p一个组死亡率；q一个组存活率；i相邻剂量比值的对数；

13、n各组动物数。,第二节 亚慢性和慢性毒性试验一、蓄积试验及其方法：（一）蓄积作用：某些物质以较小剂量反复作用于机体，可使机体对该物质的反应性增强，即一次染毒不引起明显中毒反应或死亡的剂量，经分次重复染毒后，可引起明显中毒或死亡，此种现象称为蓄积作用(accumulation)。可分两种：物质蓄积：毒物在体内的排出量小于进入量，以致毒物在体内的贮留量增多为物质蓄积；功能蓄积：毒物进入机体后，并未发现在体内明显贮留，但可引起机体功能改变的逐渐累积，导致对该毒物的反应性增强。,耐受性(tolerance)：机体多次接触化学物质后对该物质产生反应性减弱的现象，显示不易发生慢性中毒。（二）蓄积作用的测定

14、方法 有多种，常用蓄积系数法。蓄积系数(accumulation coefficient)K：ED50(n)多次染毒使半数动物出现某种效应的总剂量;ED50(1)一次染毒引起同一效应半数效量。,若以死亡为毒效应指标，上式为K越小，受试化合物的蓄积毒性越大。,1固定剂量法：固定每天染毒剂量为1/201/5 LD50，连续染毒，直至实验动物半数死亡。如果染毒剂量累计已达5个LD50 动物死亡仍末达半数，实验均可告结束，计算蓄积系数，作出评价。2递增剂量法：先测定LD50（1），然后对另一组动物每天染毒，以4天为一期，开始给予0.1LD50。以后每期按1.5倍递增剂量，直至动物半数死亡，或实验已达2

15、8天，可结束实验，计算系数。3.二十天试验法：选用大鼠或小鼠每个剂量组雌雄各10只，以1/2、l/5、1/10、1/20 LD50分别对每组进行染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50组动物有死亡，且有剂量反应关系，则有较强蓄积作用；如1/20 LD50组无死亡，则为弱蓄积。,蓄积系数的测定,二、亚慢性毒性作用及其试验方法：1、目的：确定化学物亚慢性毒性的阈剂量和NOEL。2、试验期限：3-6月；呼吸道吸收：30-90天；皮肤毒性：30天。3、试验动物的选择、饲养环境及染毒途径：试验动物选择：对受试化学物敏感的物种或品系；环境：营养合理，饮水清洁、充足、温、光、湿适宜；染毒途径：尽量模拟人

16、类在环境中接触受试化学物的途径，与急性毒性试验相似。,4、剂量选择与分组 剂量：180I50LD50，对于在体内不产生蓄积作用而排泄又快的物质可适当加大剂量，反之则可减少剂量。设34个实验组和1个对照组。实验组要求：在实验结束时 最低剂量组不产生可观察到的毒性反应；最高剂量组能引起明显毒性反应，但不引起死亡；中间剂量组产生轻微毒性反应。,5、症状观察一般性指标(非特异)一般综合性指标：动物体重增长率、食物消耗率、活动能力等。一般化验性指标：主要指血和肝、肾功能的检测。(2)特异指标：测定特异性反应。更确切阐明该物质的阈剂量(浓度)及无作用剂量(浓度)。(3)病理组织学检查：实验中死亡动物的病理

17、检查及实验结束时的尸检。,三、慢性毒性作用及其试验方法1、目的：评价化学物在长期小剂量作用的条件下对机体产生的损害及其特点确定阈剂量和最大无作用剂量。2、试验方法：（1）动物选择、染毒方法、观察指标等与亚慢性毒性试验相似；（2）染毒期限：1-2年或终身染毒，也有人提出6月。（3）剂量分组：3个染毒组和一个对照组。高剂量组：1/51/2亚慢性试验阈值；中间剂量：1/501/10；低剂量组：1/100。,第四节 致突变实验,一、目的 确定外源化学物对生物体是否具有致突变作用。基因点突变试验、染色体畸变试验、DNA损伤试验。二、供试生物：微生物、动物细胞、昆虫、动物或植物三、试验方法 体外基因突变试

18、验、细胞遗传学试验、体内基因突变试验、DNA损伤试验,（一）体外基因突变试验,1、Ames试验（鼠伤寒沙门氏菌/动物肝细胞微粒体试验）（1）原理：利用一种突变微生物菌株与被检测化学物接触，使突变型微生物回复突变，重新成为野生型微生物。,突变型微生物不具备合成组氨酸的能力，不能在不含（或低浓度）组氨酸培养基上生长。,（2）方法：将突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨酸培养基上培养,以其生长状况作为指标。在培养基中加入哺乳动物的肝细胞微粒体：提高灵敏度。,（3）特点：优点：简便、灵敏、快速（48h）、费用低；检测结果与对动物的致癌性的相符率达约90%。缺点：利用微生物作为供试物，不能全面反映哺乳动物

19、的遗传信息，仅1/6；微生物的DNA修复系统与动物有差异；微生物无免疫功能。,2、哺乳动物体细胞突变试验（1）方法原理与微生物突变类似。常用的细胞株：中国地鼠肺细胞V79 中国地鼠肺卵巢细胞(CHO）小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株。,V79、CHO细胞株正常细胞：缺乏利用嘌呤碱的酶HGPRT，不能在加入类嘌呤碱类物质的培养基上生长；突变细胞：可在加入类嘌呤碱类物质的培养基上生长。L5178Y突变细胞株正常细胞：缺乏胸苷激酶（TK），不可在含有细胞毒物5-溴脱氧尿苷的培养基上生长。突变细胞：可在此种培养基上生长。,（二）细胞遗传学试验,染色体畸变试验：直接在显微镜下观察染色体结构和数目的改变情况。

20、生殖细胞或体细胞、体外或体内试验。体外：CHO细胞:分裂快、数目适中、形态清晰；人类外周血淋巴细胞 体内：受试动物骨髓细胞或其他（胸腺、脾、精原细胞）染色体畸变率的变化。,（1）试验方法：a.体外培养：CHO细胞或人类外周血淋巴细胞与化学物，在细胞培养液（DMEM,RPM,1640或1999）中，370C下培养24h(CHO)或72h(人类细胞）。观察前2h加入秋水仙碱（中期分裂阻断剂），制片，镜检观察。b.体内染色体畸变分析：大鼠、小鼠，染毒饲养，观察骨髓细胞染色体畸变情况。,第四节 环境流行病学方法一、概念和特点：流行病学：研究特定人群中有关健康的状态和事件的分布以及影响这些分布的决定因素

21、；环境流行病学：应用流行病学的原理和方法，重点研究人们在生活和工作环境中各种因素与人群健康的关系。一般流行病学研究的内容是疾病在人群中的分布，它要回答三个问题：(1)疾病在时间、地点、不同人群中是怎样分布的?(2)什么因素是该病的主要决定因素?(3)怎样控制该病的流行?,环境流行病学除了上述一般内容，还有它本身的特点。(1)它不仅研究疾病的分布规律，而且更经常地研究疾病前的状态，即包括无异常健康)、微弱的功能改变、疾病的前期(亚临床状态)等各种健康状况，揭示环境污染或某些微量元素的健康效应。(2)环境流行病学研究的暴露因素主要是理化因素。已知暴露因素，研究其对健康的影响；环境毒理学工作者所进行

22、的大量工作就属于这种。例如金属冶炼厂铅污染大气对居民健康影响，磷肥厂氟污染大气对居民健康影响的调查等。出现健康异常，追究引起异常的暴露因素，这属于探讨病因的研究。例如，近年来我国学者对于鼻咽癌、食道癌病因的研究，对克山病、大骨节病病因的研究，均属于此种类型。日本的水误病和痛痛病的病因是重金属污染造成的公害病领域里的研究成果，影响深远。(3)环境流行病学研究的最终日的是为消除污染、改造环境、保护居民健康服务。(4)直接以人群为研究对象，研究结果最具有说服力。,二、环境流行病学研究的内容 环境流行病学主要研究两方面的内容一是暴露，二是健康；同时还要研究二者的联系。(一)暴露测量：环境暴露水平是人群

23、接触的环境因素的平均水平，是通过对环境因子在环境中的时空分布的实测结果求出的平均值。,暴露水平是估算人体接触剂量的依据，因此要求测量结果精确、可靠、有代表性。暴露测量可分为两类：环境测量和生物测量。1环境测量 通常采用对暴露的环境因素进行抽样测量的方法，估计个人暴露量。要考虑到所有可能摄入选径，估计总暴露量。2生物监测 暴露水乎的测量由于变异因素太多而很难达到精确的要求。测量人体组织、体液中的有害物质或微量元素的浓度以代表人体的暴露水平，称为“生物剂量”，也称“体内负荷”，这比环境测量的精确性高，虽然体内负荷也存在着变异。体内负荷的测量对于化学性质稳定，有蓄积倾向的物质尤为适宜。对于在体内被转

24、化和易代谢的物质，则可测定其代谢产物在体内的水平、以估计该物质的体内负荷。,(二)健康效应测量 探讨发现早期健康损害的敏感和特异的指标。对敏感人群和高危人群的健康调查是早期发现环境不利因素危害的重要途径。敏感人群：易受侵害的人群。例如，婴幼儿对铅和甲基汞等神经毒物特别敏感，婴幼儿就是铅污染或甲基汞污染的敏感人群。高危人群，就是暴露于某种可能引起持殊健康损害的污染物人群。例如铅冶炼厂的工人患铅中毒的危险性比一般居民大。国内把这两种情况统称为高危险人群。高危险人群是环境流行病学研究的重点人群。,三、环境流行病学研究方法 一般流行病学研究方法有描述性的(包括分布的描述和现况研究)、分析性的(包括病例对照和群组研究)、实验性的和理论的研究。由于环境流行病学研究的内容有其本身的特点，在采用这些基本方法时应有所选择。(1)如暴露因素已知，欲研究其健康效应，可以采用现况研究设计和群组研究设计，或实验研究设计。在选择观察指标时，应当注意人群总体的健康效应谱，即除了研究疾病状态，还应研究没有表现出临床症状的暴露人群。(2)在出现健康异常状态后，为追究其病因，可以来用病例对照研究或现况研究得病因线索后，再选用群组研究或实验研究证实。,