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1、第七章 生物技术与食品安全 和品质控制,第一节 生物传感器及其在食品检测分析中的应用,由固定化的具有分子识别功能的生物材料、换能器和信号处理放大装置组成的分析工具或系统。（一）生物传感器的基本组成和分类 1.生物传感器的基本组成 生物识别元件：生物传感器中固定化的酶、微生物细胞、抗原抗体和组织切片等具有分子识别能力的生物敏感材料。换能器：能将在生物敏感材料上进行的生化反应产生的各种信息转换成电信号的装置。信号处理装置：负责信号的分析处理和放大输出。,一、生物传感器的基本概念,2.生物传感器的分类 根据生物敏感材料可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、细胞传感器、组织传感器和DNA传感器。根
2、据换能器的不同，可分为电化学传感器、介体生物传感器、测光型生物传感器、测热型生物传感器、半导体生物传感器和压电晶体生物传感器等。以上两种分类会相互交叉，例如，酶传感器根据换能器的不同又可分为酶电极、酶热敏传感器和酶光极等。具体到某一种传感器的命名，一般是采用“功能+结构特征”的方法，例如，葡萄糖氧化酶光纤传感器等。,（二）生物传感器的工作原理 通过生物的分子识别作用，生物传感器中的生物敏感材料和生物样品中的待测物质特异性结合，并进行生物化学反应，产生离子、质子和质量变化等信号，信号的大小在一定条件下和样品中被测物质的量存在一定的关系，这些信号经换能器转换成电信号，电信号再经信号分析处理系统处理
3、后输出，反映出样品中被测物质的量。,1.分子识别（molecular recognition）生物传感器中的分子识别:指生物敏感材料中生物分子能选择性地和待测样品中的待测成分进行特异性（选择性）结合的性质。生物敏感材料包括酶、抗原（体）等免疫物质、微生物细胞、组织切片和DNA等。酶的分子识别:指酶分子只能和特定的底物分子进行结合，而不能和其他分子结合的特性。酶分子的识别能力主要是由酶的活性中心决定，其决定了以酶为生物敏感材料的生物传感器的分子识别能力。免疫传感器的分子识别：由传感器上的生物敏感材料抗原或抗体物质的分子识别能力决定，抗原和抗体象酶和底物一样也能发生特异性（选择性）结合。DNA传感
4、器的分子识别：由DNA分子中碱基对的互补结合特性决定。,2.生化反应中量的变化和信号的转换（1）热焓的变化及其转换（2）光效应及其转换（3）颜色的变化及其转化（4）阻抗的变化及其转换（5）生化反应中其他量的变化及其转化（6）直接产生电信号,3.生物放大（biological amplification）（1）酶催化放大 酶是高效专一的催化剂，它可以在很短的时间内催化大量底物的转化，通过测定酶所催化反应中底物的减少量或产物的增加量可以推测（判断）反应中比底物减少量或产物增加量少得多的酶量，或与酶相关联的其他物质的量，从而实现生物放大作用。应用这一放大原理可以使检测方法的灵敏度（最小检出量）比常规
5、检测方法提高2个数量级。,（2）底物循环放大 被测物S1或S2，在酶E1和酶E2之间不断循环，每循环一次，E1和E2都要分别消耗各自的底物C1和C2，产生对应的产物P1和P2，而循环过程中被测物S1和S2的浓度保持不变，通过分析C1和C2的消耗量或P1和P2的增加量就可以测定待测物S1或S2的量，实现放大效应。循环的次数越多酶消耗的底物和产生的产物越多，放大效率也越高（图）。,（3）酶级联放大 生物体内的有些酶（通常为酶原）本身是没有活性，在辅酶、另外一种酶或酶的变构效应物等激活剂的作用下，酶E1i被激活为酶E1a，E1a激活E2i成E2a，E2a又激活E3i或E3a，由于酶是催化剂可以连续使
6、用，这样经过一系列的反应，一个分子的辅酶或变构效应物等激活剂就能够产生成千上万分子的E3a，然后E3a催化底物S3产生产物P3，通过测定底物的消耗量或产物的生成量就可以灵敏地测定辅酶或变构效应物等激活剂的量（图）。优点：效率极高，对提高生物传感器的灵敏度极为有效。缺点：在生物传感器中的应用条件较为苛刻。,（4）脂质体技术 脂质体：由类似于细胞膜的脂质膜构成的微球体，在微球体的内部包含有被酶、荧光素或电活性物质标记的抗原或抗体等标志物，微球体的外膜上结合有抗原（抗体），当外膜上的抗原（抗体）与待测的抗体（抗原）发生反应，并和补体结合时（或在表面活性剂的作用下），微球体破裂，微球体内的标志物被释放
7、。标志物的量大且容易测定，通过测定标志物的释放量就可以测定出待测抗体（抗原）的量，从而实现生物放大（图）。缺点：目前还存在着微球体内的标志物容易渗漏和脂质体的稳定性较差等不足之处。,（四）生物传感器的特点 1.省时省力，简便快速 2.成本低 3.不需添加试剂 4.灵敏度高 5.体积小 6.易于实现自动化 7.易于推广普及,二、生物传感器中生物敏感材料的固定化和成膜技术,（一）生物材料的固定化技术 指通过物理或化学的方法将酶、微生物细胞和抗原抗体等生物材料限制在一定的区间内，使生物材料只能在特定的区间进行生化反应，而反应的底物和产物可以自由扩散的技术。生物材料常用的固定化方法包括：夹心法、吸附法
8、、包埋法、交联法、共价结合法和微胶囊法等（图）。,（二）成膜技术 1.半导体生物传感器中的成膜技术（1）紫外线照射法 在一个芯片的两个极上均匀涂上（覆盖）一层活性固定化酶膜，在其中的一极上盖上光防护罩，然后以紫外线照射，由于紫外线的穿透能力很差，因此有光防护罩一极的酶保留活性，而另一极上的酶在紫外线的照射下失活，酶失活的一极就可作为半导体传感器中的参比（图）。,（2）光平板印刷法 在一块芯片上，首先将酶和光敏聚合物（如聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等）的混合溶液涂布于芯片的两极，形成一层溶液膜,以光防护物盖住芯片，在需要有酶膜一极的部位开一个孔，然后以光照射，一定时间后，开孔一极上的光敏聚合物和酶的混合
9、物溶液膜在光的照射下聚合形成固定化酶膜，另一极则仍然为溶液状态。将芯片置于溶剂中以超声波处理，去除未聚合的聚合物溶液和酶，而光聚合后的固定化酶膜仍保留在一极上（图）。,（3）喷射法 在计算机的控制下，芯片在特定喷嘴和戊二醛蒸汽室间来回运动，当芯片上需要成膜的部位到达喷嘴处时，喷嘴将酶和其他高分子材料（例如牛血清白蛋白）的混合溶液滴注在该部位，然后进人戊二醛蒸汽室进行适度的交联成膜。如此重复数次，最后将整个芯片浸入戊二醛溶液中，进一步交联。,2.L-B膜技术 一种能在低温低压条件下制备高密度、分子排列方向一致的单分子层或多分子层薄膜的技术。以这种技术制成的膜以该技术的发明者Langmuir和Bl
10、odgett的名字命名，称为L-B膜。基本原理：生物大分子，例如脂质分子和某些蛋白质分子，在特定的条件下，在洁净的水表面展开后能形成水不溶性的液态单分子膜，小心压缩表面使液态膜逐渐过渡成为一分子厚度的拟固态膜（图）。优点：L-B膜可以很薄（数纳米以下），便于传感器的微型化而且响应时间短。L-B膜的构造和生物体内的膜构造很相似，有较好的仿生价值，便于制备可以在体内使用的生物传感器。,三、生物传感器在食品安全和品质控制中的应用,（一）农药和抗生素残留的分析 1.农药残留的生物传感器检测 目前有机磷农药中的马拉松、甲基马拉松、乙基马拉松、速效磷、久效磷和百治磷等，以及氨基甲酯类农药中的滴灭威、西维因
11、、灭虫多和残杀威等农药在食品中残留量的生物传感器检测都有相应的研究报道。1996年余孝颖等采用离子敏场效应管为基础传感器（换能器），将乙酰胆碱酯酶通过戊二醛共价交联固定于场效应管上，制备得到了乙酰胆碱酯酶场效应管传感器，用于分析敌敌畏等有机磷农药的残留。,原理：乙酰胆碱酯酶能催化乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，当存在有机磷农药残留时，它们能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性，从而使底物的分解减少，胆碱和乙酸的产生减少，其中乙酸的减少量可以通过离子场效应管来测定，且在一定条件下，乙酸的减少量和有机磷农药的量之间存在一定的比例关系，因此根据乙酸的减少量就可以计算出有机磷农药的残留。,2.抗生素残留的分析 青霉素和
12、磺胺是兽药中常用的抗生素，其残留会污染动物性食品，从而对人类的健康造成危害。Sternesioes等人采用免疫传感器测定了牛奶中硫胺二甲嘧啶的含量，灵敏度达到1ngg，传感器表面经NaOH和HCl处理后可以重复使用。Avon等用抗体酶共轭物为敏感材料结合光度分析法检测了牛奶中青霉素的含量。,（二）食品添加剂的分析 亚硫酸盐是常用的食品防腐剂和漂白剂，但是亚硫酸盐容易引起哮喘，美国FDA规定了其在新鲜水果和蔬菜等食品中的含量不得超过110-6molL。天冬酰苯丙氨酸甲酯，又称甜味素，是人工合成的低热量甜味剂。烟碱酸属于B族维生素，可以作为肉类食品的发色剂，但是人体摄入过量的烟碱酸会引起瘙痒和头痛
13、等中毒症状，在日本已禁止使用。其他食品添加剂，如防腐剂苯甲酸钠、羟基苯甲酸钠、过氧化氢，抗氧化剂抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、儿茶酚、儿茶酚胺，发色剂亚硝酸，酸味剂磷酸和乳酸等都可以用相应的生物传感器来检测它们在食品中的含量。,（三）污染微生物的检测 污染食品的微生物可以分为腐败菌和病原菌。腐败菌主要是通过对食品成分的分解和破坏，同时产生有毒有害物质从而对人体造成危害。腐败菌本身通常不是致病菌。病原菌除了能破坏食品的组成成分外，其菌体本身也能使人致病。食品中污染微生物的检测方法通常是平板计数法，其操作繁琐，检测时间长，特别是对于病原菌的检测，有时长达l-2周才能出结果，因此各种快速检测方法不断涌现，
14、生物传感器检测方法就是其中的一种。,1.腐败菌的检测 酿酒酵母、乳酸菌和枯草芽孢杆菌等是常见的食品腐败菌。2.病原菌的检测 常见的污染食品的病原菌有沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、产气荚膜梭菌和蜡样芽孢杆菌等。这些病原菌按常规的检测方法检测时间很长，而采用生物传感器则能迅速地测定它们的数量。用来测定病原菌的生物传感器主要是光纤生物传感器、免疫生物传感器和DNA生物传感器。目前，上述病原菌都可以用相应的生物传感器来测定。,（四）生物毒素的检测 污染食品的生物毒素主要包括细菌毒素、真菌毒素、藻类毒素以及动植物毒素，其中以细菌毒素和真菌毒素最为常见。检测毒素的方法包括色谱法（气相色谱
15、、液相色谱、薄层层析等）和生物学方法等，这些方法检测时间长，对样品的前处理复杂繁琐。以免疫学方法和生物传感器检测方法为代表的各种快速方法备受欢迎。,1.细菌毒素的分析 细菌毒素是由细菌分泌产生于细胞外或存在于细胞内的致病性物质，有内毒素和外毒素之分。内毒素：革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分之一的脂多糖，热稳定，抗原性差，不能转化为类毒素，毒性比较弱，毫克水平才能引起动物死亡。外毒素：细菌（主要是革兰氏阳性菌，也有少数革兰氏阴性菌）分泌于胞外的一种蛋白质，热稳定性差，抗原性强，能转化成类毒素，毒性很强，微克水平就能引起动物死亡。目前研究报道主要集中在运用免疫生物传感器分析检测肉毒毒素和葡萄球菌肠毒
16、素等细菌外毒素。运用生物传感器能灵敏、准确、快速地检测到它们在火腿和奶油等食品中的含量。,2.真菌毒素的分析 真菌毒素是真菌分泌产生的有毒次生代谢产物。常见的污染食品的真菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭霉素、杂色曲霉素、T-2毒素、腐马素、镰刀菌烯醇类毒素、展青霉素和橘霉素等。检测食品中污染真菌毒素的方法主要有薄层层析法和液相色谱法等。近二十多年来免疫学方法在真菌毒素的检测中得到了较好的应用，以此为基础的免疫生物传感器快速检测真菌毒素的方法也有研究报道和应用，其中以免疫传感器用于检测黄曲霉毒素B1和腐马素B1的研究报道最多。此外，也有运用微生物传感器和以纤毛虫为生物敏感材料的传感器检测展青霉素、黄曲
17、霉毒素B1和T-2毒素的研究报道。3.其他生物毒素的检测 也有用于检测食品中污染的动植物毒素。,（五）食品新鲜度的分析 1.鱼鲜度传感器 鱼死亡后，鱼肉中ATP（三磷酸腺苷）在ATP酶的作用下分解成ADP（二磷酸腺苷），ADP在磷酸激酶的作用下分解产生AMP（一磷酸腺苷），AMP在AMP脱氨酶的作用下转化为IMP（肌苷酸），IMP在5-核苷酸酶的作用下分解成HxR（肌苷），HxR在核苷磷酸化酶的作用下分解成Hx（次黄嘌呤），Hx在黄嘌呤氧化酶的作用下分解成尿酸。即：ATPADPAMPIMPHxRHx尿酸,根据鱼死亡后，鱼肉中ATP分解代谢后各种代谢产物之间的比例关系，即K值或K1值也能很好地评
18、判鱼的新鲜度。K值：指上述ATP代谢产物中，肌苷和次黄嘌呤占ATP代谢产物总量的百分数。即：K（%）=（HxR+Hx）（ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx）100 鱼死亡后ATP、ADP和AMP的代谢非常快，一般在很短的时间（24h）内，它们在鱼肉中的含量就几乎为零，而一般在市场上出售的鱼都是死亡24h以后的鱼，K值可简化为K1值。即：K1（%）=（HxR+Hx）（IMP+HxR+Hx）100,目前日本等国已制订了根据K值或Kl值判断鱼新鲜度的标准，也成功研制了测定K值或K1值的各种生物传感器。按照日本的标准，K10.2时，鱼的品质极好，Kl时，鱼品质较好。（1）多电极传感器系统。主
19、要由四根氧电极组成，其中一根作为参照，另外三根电极的表面分别固定有黄嘌呤氧化酶膜，核苷磷酸化酶与黄嘌呤氧化酶膜，5-核苷酸酶、核苷磷酸化酶与黄嘌呤氧化酶膜，测定时将四根电极同时放入样品液中，上述三根酶电极产生的电信号分别反应了样品液中Hx的浓度，（HxR+Hx）的浓度和（IMP+HxR+Hx）的浓度，通过计算机处理很容易计算出K1的大小。运用该传感器，只需20-50L样品液，8min就可以测定K1值。,（2）多酶电极传感器系统。首先将5-核苷酸酶、核苷磷酸化酶与黄嘌呤氧化酶固定在一氧电极上，形成多酶电极。测试时，样品液先经过一离子交换柱，使IMP、HxR和Hx分开，然后分别流经有多酶电极的测试
20、室，根据样品中不同组分流经测试室时电信号的响应情况，运用计算机分析计算出K1值。除了测定K1值，也有通过生物传感器测定鱼肉中胺类物质的变化来反应鱼新鲜度的研究报道。另外，采用微生物传感器测定鱼鲜度的研究也有报道。,2.肉鲜度传感器 和鱼肉一样，其他肉类也可以通过生物传感器来测定其鲜度。Kurube等人将单胺氧化酶固定于氧电极上组成了测定猪肉鲜度的酶传感器，该传感器的响应时间为4min,检测的线性范围为510-6-1010-6mo1L。Kress等人研制开发出一种测定肉鲜度的匕首式生物传感器，测定时将传感器的探头插入肉表面2-4cm深度，通过测定葡萄糖的浓度来评价肉的鲜度。3.牛乳鲜度传感器 主
21、要通过测定牛乳中的微生物数量，牛乳的乳酸增加量，或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量等来评价牛乳的鲜度。,第二节 免疫学技术与食品安全检测,（一）抗原（antigen）指进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。1.抗原的分类和基本属性 半抗原（hapten）:不能刺激动物产生抗体，只能和对应的抗体进行特异性结合，即只有免疫反应性，无免疫原性的抗原。,一、抗原与抗体,完全抗原（complete antigen）：既具有免疫原性又具有免疫反应性的抗原。超级抗原（superantigen）：有些物质，例如某些细
22、菌毒素，具有非常强的免疫刺激能力，通常可达到一般抗原刺激能力的2000倍，只需极低的浓度就可以诱发极大的免疫反应。免疫原性（immunogenicity）:指抗原进入体内刺激免疫系统产生抗体或形成致敏淋巴细胞的特性。免疫反应性（immunoreactivity）:指抗原能和对应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的特性。,2.抗原决定簇（antigenic determinant）或称为抗原表位，是位于抗原物质分子表面或者其他部位的具有一定组成和结构的特殊化学基团，能与免疫系统中淋巴细胞上的受体及相应的抗体分子结合，是免疫原引起机体特异性免疫应答和免疫原与抗体特异性反应的基本构成单位。在蛋白质抗
23、原中，3-8个氨基酸残基可以构成一个抗原决定簇，在多糖抗原中3-6个呋喃环可以组成一个抗原决定簇。从结构上抗原决定簇可以分成顺序决定簇和构象决定簇。,顺序决定簇（sequential determinant）：又称为连续决定簇，氨基酸的排列顺序决定着这类决定簇的功能基团。构象决定簇（conformational determinant）：又称为不连续决定簇，是依赖于蛋白质天然空间构象的决定簇，这类决定簇通常由不连续的氨基酸顺序片段经肽链的折叠卷曲而成，一般位于蛋白质的表面。研究抗原的决定簇不仅可以揭示抗原与抗体结合的本质，有助于更好地了解免疫学中的核心问题免疫识别和应答的机制，而且可以人工合成
24、某些抗原决定簇，这对于研制疫苗和特异性诊断试剂，以及药物合成和抗病毒感染等方面都有很大的益处。,3.抗原的分类 根据来源抗原可分为天然抗原、人工抗原和合成抗原等三类。天然抗原：是天然的生物、细胞及天然产物，主要来自动物、植物和微生物，例如血细胞、细菌和病毒、蛋白质、多糖、脂类和核酸等都可以是天然抗原。人工抗原：指人工化学改造后的抗原，例如半抗原经化学改造后就是人工抗原。合成抗原：指化学合成的具有抗原性质的分子，主要是氨基酸的聚合物。,4.抗原的制备（1）抗原的准备。对微生物细胞等颗粒状抗原，只需对微生物进行扩大培养，然后收集菌体即可。对蛋白质、多糖、DNA和脂类等可溶性胶体抗原，应根据其在生物
25、细胞中的部位进行处理。存在于细胞内的物质首先应破细胞壁，使它们释放出来，然后收集含有这些物质的溶液，再采用各种分离、提取和纯化方法进行分离和提取。对于分泌于细胞外的这些高分子物质则只需收集胞外液，然后再进行分离纯化即可。,（2）半抗原的改造。通常是将牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OV）或人工合成的多聚氨基酸等连接在半抗原分子上，增加其相对分子质量，从而使其转化成完全抗原（例子见书）。将各种半抗原转化成完全抗原的具体操作方式和注意事项各不相同，但是有一点必须注意，即在操作过程中应尽可能保持半抗原结构的“完整性”，不能过度破坏其结构，以保持半抗原的“原始性”。,（二）抗体（amtibody,
26、Ab）1.抗体的定义、分布和分类 由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）。抗体主要存在于动物血清中，也存在于动物的其他体液和体外分泌液，例如乳汁和细胞分泌液中。另外，抗体还存在于某些细胞中。根据Ig的理化特性和与抗原结合方式的不同，Ig可以分为类和亚类。,2.抗体的结构 一个抗体分子通常包括两个完全相同的轻链分子（1ight chain）和两个完全相同的重链（heavy chain）分子，轻链分子大约由210个氨基酸残基组成，相对分子质量约为2.3104；重链分子大约由450个氨基酸残基组成，相对分子质量约为5.01
27、04。这4条链在氢键和二硫键（S-S）作用下连在一起，形成“Y”字形结构。在“Y”字形的两个支角上，重链和轻链的N端区域在一起形成抗原的识别位点。有一段大约110个氨基酸残基的区域随抗体结合特异性的不同而变化，这端区域叫可变区。除可变区外，抗体分子上还有恒定区。,3.抗体的制备（1）多克隆抗体的制备 以抗原免疫实验动物可以获得含有特异性抗体的血清，即抗血清。抗血清中的抗体是由不同的抗原决定簇刺激不同的B细胞克隆产生，这种抗体又称为多克隆抗体。制备多克隆抗体包括：实验动物的选择。用于制备多克隆抗体的实验动物包括哺乳类的鼠、兔、羊、马、驴、豚、鼠、猪、猴、狗和禽类的鸡、鸭、鸽子，以及两栖类的蛙等，
28、其中最为常用的是鼠、兔和羊等。,在选择实验动物时首先应考虑抗原的来源和免疫动物的亲缘关系。一般来说，两者的亲缘关系越远则产生的抗体效价越高，相反则抗体的效价越差。实验动物的年龄和营养状况与抗体的产生也有密切的关系，年龄太小易产生免疫耐受；而年龄过大或营养不良则动物的免疫能力低下，也不易产生高效价的抗体。选择好实验动物后，在注射抗原前应采集少量的动物血清（阴性血清）和抗原进行血清学反应，选择不和抗原反应的动物进行免疫实验。,抗原的处理。除了前面叙述的抗原的分离提纯和半抗原的改造外，对于可溶性抗原，在注射免疫动物之前通常还需和免疫佐剂进行混合（颗粒抗原一般无需和佐剂混合，可以直接注射），以提高抗原
29、的免疫原性等。佐剂（adjuvant）：是具有增强机体的免疫应答能力，延长抗原在机体内的半衰期，降低抗原毒副作用，以使机体产生高效价抗血清的物质。最常用的佐剂是福氏佐剂，它分为完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂。不完全福氏佐剂：由1-6份的液体石蜡和1份羊毛脂充分混合而成。完全福氏佐剂：在不完全福氏佐剂的基础上，于使用前添加灭活的（2-20mgmL）卡介苗混合而成。,动物的免疫。动物的免疫是一个非常复杂的过程，在免疫过程中，对抗原的免疫剂量、注射途径、加强免疫的时间间隔和加强免疫的次数等都需要认真综合考虑。抗原的剂量应根据抗原的免疫原性强弱、动物的种类和大小以及抗原的注射途径等来决定。对于同一种抗原
30、，在一定的剂量范围内，抗原的注射量与免疫反应的强度成正相关，抗原量过大或过小都易产生免疫耐受。免疫动物越大一次注射抗原的量也越多，小鼠一次注射的免疫乳液量为1-2mL，家兔的为2-4mL。,常用的抗原注射途径包括静脉、脾脏、淋巴结、腹腔、肌肉、皮下和皮内等，它们对抗原的收速度为静脉脾脏淋巴结腹腔肌肉皮下皮内。腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、皮下注射和淋巴结注射适合于任何抗原，这些途径主要是通过刺激局部淋巴结发生免疫应答，初次免疫和加强免疫都可以使用。静脉注射只适合于可溶性抗原和分散的单细胞悬液，且不能使用佐剂，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。脾脏注射比较适合于微量抗原。,抗血清的采集、纯化和特性
31、鉴定。抗体的分离纯化方法很多，包括中性盐沉淀法、凝胶柱层析、离子交换柱层析和亲和层析等。对收获后的抗血清或纯化后抗体的一些参数，例如效价、亲和力和交叉反应等进行分析非常必要。效价又称为滴度（titer）：在一定条件下，抗血清经系列稀释后与定量的抗原反应，以能检测出抗血清存在的抗血清的最大稀释倍数，是表达抗血清中特异性抗体相对含量的一个指标。,亲和力（affinity）：表示抗原抗体结合程度的指标，亲和力的大小可以用抗原抗体反应的平衡常数K来表示。抗血清的交叉反应：衡量抗体特性的另一个重要的指标。理论上讲，抗体只能与产生该抗体的抗原发生反应，这是抗体特异性的表现，但实际上抗体还可以和其他抗原发生
32、反应，即所谓的交叉反应。一方面是由于抗原的不纯造成，另一方面不同抗原间相同或类似的抗原决定簇也是产生交叉反应的原因。完全没有交叉反应的抗体是不存在的，但是交叉反应太强的抗体没有应用价值。,（2）单克隆抗体（monoclonal antibody）的制备 制备原理：免疫致敏后的B淋巴细胞具有分泌特异性抗体的能力，但是在体外不能长期存活；而骨髓瘤细胞可以在体外长期存活但不能产生抗体；如将两种细胞杂交融合后，经分离筛选获得既能在体外长期存活又能针对单一抗原决定簇产生特异性抗体的融合子，就可以获得单克隆抗体。单克隆抗体是通过B淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交获得，单克隆抗体制备技术又称为杂交瘤技术。,单克隆抗
33、体的制备 小鼠骨髓瘤细胞和B淋巴细胞的准备。小鼠骨髓瘤细胞有很多不同的株系，我国最为常用的是SP20和NS-1。细胞的融合和融合者的筛选。通常骨髓瘤细胞和B淋巴细胞是在聚乙二醇（PEG）的促进下进行融合的，也可以采用电融合的方式进行融合。阳性杂交瘤细胞的检出和单克隆化。采用酶联免疫吸附法和放射免疫分析法等方法将阳性杂交瘤细胞检测出来。,单克隆抗体的扩大培养。生产大量单克隆抗体的方法目前常用的主要有小鼠腹水制备、大瓶培养和中空纤维反应器培养，前者仅适合于实验室制备单克隆抗体，后两者适用于工厂化生产大量的单克隆抗体。单克隆抗体的性质的鉴定：获得单克隆抗体后，和多克隆抗体一样，也需对其效价、亲和力和
34、交叉反应（特异性）进行分析。另外，还需对免疫球蛋白的类和亚类以及结合位点等进行分析。,（3）生物工程抗体（biological engineering antibody）应用生物工程技术对抗体进行定向改造获得的抗体。抗体的化学修饰：运用双功能交联剂将同位素、酶、毒素和药物等连接在抗体的Fc片段上，抗体和抗原的特异性结合发生在抗体的Fab片段上，交联后并不影响抗体与抗原的结合，交联（标记）后的抗体可以作为诊断试剂，也可以作为药物的定向载体，引导药物或毒素到达抗原存在部位，使药物或毒素发挥更有效的作用，即所谓的“生物导弹”。这样可以大大减少药物和毒素等在肿瘤等治疗过程中的毒副作用，提高治疗效果。,
35、抗体基因文库（antibody recombination library）：将不同重链和轻链的基因随机组合，克隆到适合的表达载体中，在原核细胞中表达不同的抗体，从而形成一个抗体文库，运用抗原可以从中筛选到相应的抗体基因。抗体基因的改造（antibody gene modification）：将不同来源的抗体基因进行重组，可以获得所需要的抗体。催化性抗体或抗体酶：具有催化活性的抗体。抗体酶和酶一样具有底物和立体专一性，在反应动力学和竞争抑制等方面也和酶相似。,二、常用的免疫学方法,（一）免疫学方法的分类 抗原抗体的特异性结合可以发生在生物体内也可以发生在体外，用于食品卫生和安全检测的免疫学方法
36、都是抗原抗体的体外反应，通常都需要使用含有特异性抗体的血清，这些方法又称为血清学反应或血清学方法。根据给出的检测结果是定性的还是定量的，免疫学方法（血清学方法）可以分为定性免疫学方法和定量免疫学方法。,定性免疫学方法：能给出分析样品中是否含有某种特定的抗原或抗体，或者特定抗原或抗体的含量是否高于或低于某一数值。定量免疫学方法：能给出样品中特定的抗原或抗体的准确数量。根据免疫分析过程中是否需要将结合在一起的抗原抗体复合物和没有结合的游离的抗原抗体分离开来，免疫学方法可以分为均相免疫学方法和非均相免疫学方法。,均相免疫学方法：无须将抗原抗体的复合物和游离的抗原抗体分开，一般在较短的时间内就可以得到
37、分析结果，操作比较简便，但是通常灵敏度较低，一般仅适合于定性分析。非均相免疫学方法：需要将抗原抗体复合物和游离的抗原抗体等物质分开，反应时间较长，操作比较复杂，但是在去除游离抗原抗体的同时也去除了分析样品中的一些杂质，减少了样品杂质对分析结果的干扰，因此灵敏度和特异性都比较高，适合于定量分析。根据免疫反应过程中的现象和特征等，免疫学方法又包括凝集反应和沉淀反应等。,凝集反应：颗粒抗原（例如细菌、血红细胞等）或可溶性抗原（抗体）结合于不溶性的载体微粒上后与相应的抗体（抗原）在适当的条件下，经一定时间后凝集成肉眼可见的凝聚物。沉淀反应：可溶性抗原（例如蛋白质、多糖、类脂或它们的复合物）与相应抗体在
38、适量的电解质存在的条件下发生特异性结合，形成抗原抗体复合物并出现肉眼可见的沉淀，这种可见的沉淀只有在抗原抗体比例适合时才能形成，在固体（或半固体）载体中这种沉淀表现为沉淀线，在液体中则常表现为絮状沉淀。,标记免疫学技术：指抗原（抗体）被酶、同位素和荧光素等标记（连接）后与相应的抗体（抗原）反应，通过测定酶催化反应的产物量、同位素的放射性强度或荧光素产生的荧光强度来计算抗原抗体的结合量，进而计算出待检测物质（抗原或抗体）量的方法。根据标记物的不同，标记免疫学技术可以分为酶免疫分析（enzyme immunoassay）、放射免疫分析（radioimmunoassay）和荧光免疫分析（fluore
39、scent immunoassay）。,（二）酶免疫分析方法（enzyme immunoassay）与荧光免疫方法和放射免疫方法（RIA）相比，酶免疫方法（EIA）有很多优点。目前，前面两种方法正逐步被酶免疫方法所取代。1.灵敏度 EIA的灵敏度比RIA的更高，用于EIA的酶的检测限值可以达到0.002101811018mol/100min,个别报道甚至可以检测出一个酶分子；125I及其标志物最低检测限值为51018101018mol/100min。,2.对人的危害 EIA中酶标物对人体和环境均无害，使用不受限制；RIA使用的放射性标志物对人和环境均可能造成危害，使用将可能受到越来越严格的限制
40、。3.检测仪器 EIA简便，可自动化也可以半自动化，甚至凭肉眼也可以判读结果；RIA检测仪器价格较贵，难以自动化，肉眼一般不能判断结果。4.试剂的稳定性 在合适的保存温度和介质中，酶标试剂即使在稀释的溶液中也可以保存一年至数年之久；放射性标志物由于受到放射性元素半衰期的限制一般保质期较短。,5.多样性 EIA可以用于制备标志物的酶种类很多，酶标物的种类多。另外，一种酶标物由底物的不同又可以产生多种检测信号；RIA可用于制备标志物的放射性元素较少，最常用仅有125I。6.反应体系要求 酶标物反应时对pH值、温度等要求较严格。另外，酶标物需要和底物反应一段时间后才能判读结果；放射性标志物对反应体系
41、的要求不高，可以即时判读结果。三种方法最本质的区别是标记物的不同，荧光免疫分析以荧光素为标记物，放射免疫分析以同位素为标记物，酶免疫分析以酶为标记物。由于标记物的不同，具体的分析操作过程也有许多不同。,三种方法的基本的原理相同，都是以标记物（荧光素、同位素或酶）标记抗原或抗体，之后和相应的抗体或抗原反应，形成带有标记物的抗原抗体复合物，测定复合物中标记物产生的各种信号，即荧光的强度、放射性强度或酶催化底物产生的产物量，在一定的范围内信号的强弱反映了抗原抗体复合物的量，根据信号的强弱可以计算出和标记抗原抗体结合的待测物（抗体或抗原）的量。酶免疫方法至少包括酶标记免疫方法、非标记酶免疫方法和酶免疫
42、电镜方法。酶联免疫吸附方法（ELISA）是目前应用得最为普遍的一种酶免疫方法。,2.酶联免疫吸附方法（ELISA）（1）原理 以96孔、48孔或40孔的聚丙乙烯塑料微孔板（酶标板）为载体，在适当的条件下使抗原或抗体上包被（吸附）在酶标板微孔的内壁上成为包被（固相）抗原或抗体，没有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去。然后直接加入酶标记抗体或抗原形成酶标记的抗原抗体复合物固定在微孔或试管，没有吸附的酶标记物洗涤去除。加入酶底物溶液（通常没有颜色）于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的产物。在一定的条件下，复合物上酶的量（也反应了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色
43、泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的含量。,（2）分类 直接法（direct ELISA）:指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标板上的抗体或抗原的量（图）。间接法（indirect ELISA）:将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以反映一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（图）。,夹心法（sandwich ELISA）:先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标
44、的抗体与之反应形成抗体抗原酶标抗体复合物；也可以像间接法一样应用酶标二抗和抗体抗原抗体复合物结合形成抗体抗原抗体酶标二抗复合物（图），前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。竞争法：在抗原抗体反应过程中有竞争现象的存在。例子：直接法中的酶标抗原竞争法（见书）。,（3）ELISA的操作过程 试剂的准备：主要试剂有抗原抗体、酶标抗原或抗体、酶和底物等。酶标抗原或抗体是ELISA的核心试剂，这些试剂可以自己制备也有现成的试剂（例如酶标二抗），可以购买。在自己制备酶标物时，除了应准备好纯化的抗原和抗体外，还应准备好纯化的酶，酶可以自己从动植组织或微生物中提取，但过程复杂，而且纯度和活性通常很难保证，最
45、好从试剂公司购买。,酶和抗原或抗体连接方法的基本原理和酶固定化方法的原理相同，常用的方法包括：以戊二醛为交联剂的戊二醛法和以过碘酸盐为氧化剂的过碘酸氧化法等。ELISA中常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、-D-半乳糖苷酶（BG）、脲酶（urease）等，其中HRP和AP应用最多。HRP的底物很多，在ELISA中常用是邻苯二胺与双氧水和5-氨基水杨酸与双氧水等。AP常用的底物是对位硝基酚磷酸酯和酚酞单磷酸酯等。,ELISA的操作过程：间接竞争ELISA测定黄曲霉毒素B1（AFB1）。抗原的包被（antigen coating）。将AFB1与牛血清蛋
46、白（BSA）的连接物AFB1-BSA（也可以是卵清白蛋白的连接物AFBl-OV）溶解于0.1molL pH9.5碳酸盐缓冲液中，将溶液加入酶标板的微孔内，通常每孔加200L，4放置过夜，取出恢复至室温，倾去微孔内溶液（包被液），以含有0.05%的Tween-20的pH7.0的0.05molL的磷酸盐缓冲溶液生理盐水（PBST）满孔洗涤三次，每次5min，扣干，即得到包被有AFB1-BSA的酶标板。在这个过程中AFB1-BSA通过物理吸附包被（黏附）在酶标板微孔的内壁上，没有包被的抗原洗涤去除。,封阻（blocking）。指酶标板被抗原包被后，在微孔中加入一定浓度BSA、OV、明胶或脱脂牛奶等溶
47、液以封阻微孔内没有被抗原包被的空隙，避免抗体的非特异性吸附于这些空隙，以提高实验结果的准确性和可靠度的过程。常用的封阻剂包括BSA、OV、明胶和脱脂牛奶等，其中以脱脂牛奶较为便宜，而且封阻效果和其他几种封阻剂没有明显的差别（图）。,抗原抗体竞争反应（competitive reaction of antigen and antibody）。在酶标板的每个微孔中加入一定量（例如90L）的适当稀释度的抗体（抗血清），同时分别加入一定量（例如10L）的不同稀释倍数的AFB1标准溶液，或待测样品的抽提液（不同浓度的AFBl标准溶液用于作标准曲线），混匀，37保温保湿1-2h，包被在酶标板上的固定抗原（
48、AFBl-BSA）和添加的AFBl或样品抽提液中的AFBl等游离抗原竞争抗体的结合位点，HBST洗涤扣干三次，游离的抗原抗体复合物被洗涤去除。,酶标二抗与抗原抗体复合物的反应（reaction 0f second antibodv labeled enzyme and antigen-antibody complex）。将一定量（例如100L）适当稀释的酶标二抗溶液加入各反应孔，37保温保湿1-2h，酶标二抗和抗原抗体复合物反应，形成抗原-抗体-酶标二抗的复合物固定在酶标板上，PBST洗涤扣干五次，将游离多余的酶标二抗去除。底物显色反应和吸光值的测定（color reaction substr
49、ate of OD detection）。每孔加反应底物100L（40mg邻苯二胺溶于l00mL pH5.0的0.2mol/L柠檬酸0.1mo1L磷酸氢钠缓冲溶液，加入150LH2O2,现配现用），37保温保湿，避光反应30min，每孔加50L molL H2SO4终止反应。5min后，以酶联免疫测定仪于490nm测吸光值。,ELISA竞争抑制曲线（competitive inhibitory curve of ELISA）。以AFBl标准物溶液中的AFBl的浓度对数为横坐标，以不同AFB1浓度所对应的吸光值和AFBl浓度为零时吸光值的比值的百分数（称为竞争抑制率）为纵坐标，绘制ELISA竞争
50、抑制曲线。根据样品抽提液的吸光值，利用竞争抑制曲线，计算出样品中AFBl的含量。,（4）ELISA的进展 在灵敏度方面，ELISA（包括其他酶免疫方法）的灵敏度依赖于免疫反应试剂（主要是抗体）的特异性（specificity）与亲和力（affinity）、酶结合物的比活度（在酶活性一定的情况下主要是酶的结合量）和酶反应产物的可检测极限三方面的因素。近几年来，围绕后两个因素开展了大量的研究，各种放大系统被引入ELISA中，大大提高了ELISA的灵敏度，拓宽了其检测范围，而且放大系统的引入并没有增加ELISA的操作难度，只是在常规ELISA的基础上做了一些增添和改进，目前这些方法正逐渐成为ELIS
