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1、紫外可见分光光度法,紫外可见分光光度法(UV-VIS)操作简便、快速、准确度较高，同时由于仪器价格相对较低，因此在体内药物分析中应用广泛。但由于该方法不具备分离能力，使得其专属性在体内药物的测定中受到一些影响，但如能配合适当的分离手段，如溶剂提取或层析分离，或采用一些特殊的分离测试手段仍可以使专属性得到大大改善。因此当体内药物浓度达到比gml水平且能采取正确、合理的分离手段时，分光光度法仍然是一个可行的、较好的测定方法。,原理：,紫外可见分光光度法的定量依据是BeerLambert定律。A-1gTECL,由此看出，吸收度与浓度(C)或液层厚(L)成正比关系，当溶液浓度C一定时，A与E成正比.因
2、此在定量分析中，尽可能选E值较大的波长处测定以提高测定的灵敏度，如果溶液中同时存在两种或两种以上吸光物质时，只要共存物不互相影响也不改变各自本身的吸收系数，则溶液的吸收度是各组分吸收度的加和，各组分的吸收度由各自的浓度与吸收系数所决定。,物质对光吸收的加和性是测定混合组分的依据。当溶液中有干扰测定的物质存在时，如不采用特殊测定技术将干扰组分消除，就必须采取分离手段消除干扰，否则无法得出被测药物的准确含量。,常用样本处理方法：,液-液萃取：血液中的一些成分常在250一270nm有吸收，如不经处理会对测定造成干扰，因此在测定前应采用必要的分离技术消除干扰。液液萃取技术在分光光度法中应用较多，根据样
3、品中干扰物质的多少及所用有机溶剂分离能力的强弱，可采用一次或二次提取的方法。,一般情况下二次萃取的回收率较一次萃取低，但样本净化好，并可以通过调节测定液的pH值改变被测物的吸收光谱，使之避开干扰，所以二次萃取的方法在HPLC上及GC法中相对运用较少，而在紫外-可见分光光度法中相对应用较多。在应用紫外可见分光光度法测定体内药物分析时究竟采用一次提取还是二次提取，应根据被测药物浓度、所用有机溶剂提取能力的强弱、分析方法的专属性等全面考虑。,萃取后化学衍生化：前面曾提到分光光度法不具备分离能力、在休内药物的测定中如采用化学衍生化技术可以改变被测物的结构并使光谱发生变化，避开内源性物质的干扰，提高测定
4、方法的专属性、准确性及灵敏度。,固相萃取：20世纪70年代初开始应用，样本制备时间短、所需样本量少、不会发生乳化且便于自动化操作，所以近几年发展很快。举例：固相萃取-紫外导数光谱法测定生物检材中安眠酮含量 仪器：日本岛律250型紫外可见分光光度计 方法：取组织匀浆1g，2次各加6高氯酸5m1，振摇，离心，倾出并合并上清液。取用甲醇洗去杂质后烘干的GDX403微球50mg，加甲醇约0.3ml活化后加入上清液中，振荡30min后将微球滤集于150.5cm的层析柱中，用水30m1淋洗后用二氯甲烷7mL洗脱，洗脱液置沸水浴上蒸至近干，残留物用0.1mol/L的盐酸4ml溶解，测定溶液的二阶导数光谱。,
5、计算分光光度法,等吸收双波长消去法：原理：由于物质对光的吸收呈加和性，当测定混合物时，如能在干扰物的光谱上选择吸收度相等的两波长1和2，则在1和2处测得的干扰物的吸收度差值A=0；由于被测物在所选的两波长处吸收度不等于零，因此在这两波长处测得的吸收度差值A只与被测物浓度成正比。应用等吸收双波长消去法时，注意要求干扰物在所选的两波长处吸收度相等，而被测物在这两波长处的A值足够大，这样才能有较大的测定灵敏度。,举例：双波长紫外分光光度法测定氨茶碱血药浓度 取空白血清及含茶碱15gm1的血清各0.5 m l,按样品处理方法操作,提取液在分光光度计上扫描得各自的图谱,从图谱上看出,在274 nm 处,
6、茶碱有最大吸收,空白血清提取液也有吸收,对测定结果有干扰。经测定空白血清在274nm 与298 nm 处的吸收基本相等,同时A=A 274-A 298与血清中茶碱有良好的线性关系,因此用双波长紫外分光光度法测定血中茶碱浓度,可消除空白血清的干扰。,导数光谱法：所谓导数光谱是吸收度关于波长的一阶或多阶微分对波长的函数。为了与经典的紫外分光光度法区别，我们把以吸收度为横坐标波长为纵坐标作图得到的光谱称为零阶光谱，把以吸收度的变化(dA)对波长变化(d)的变化率(dAd)对波长作图得到的图谱称为一阶导数光谱，以此类推可得到更高阶数的导数光谱。随着导数阶数的增高，峰的个数也增多，而且峰形更尖锐，原函数
7、上的一些特征，如极值点(峰或谷)、拐点等在各阶导数图像上都有相对应的更明确的显示，因此导数光谱可以提高分辨能力。,根据光的吸收定律：ACL，一阶导数dAdddCL 二阶导数d2Ad2d2d2cL，依次类推，在任意波长处，导数光谱上的导数值与浓度成正比，这就是导数光谱定量的理论依据据。20世纪60年代后期，有了双波长分光光度计，20世纪70年代中期，微处理机被装配到了分光光度计上，人们利用它的记忆及数据处理功能，可以直接描绘出一阶、二阶、三阶、四阶等导数光谱，这样就使得导数光谱的应用得到较快的发展。由于导数光谱灵敏度高、分辨能力好，能消除杂质干扰，提高被测物光谱的纯度，作为一种紫外分光光度法的定
8、量方法，受到人们越来越多的重视。,差示分光光度法：差示分光光度法消除干扰是基于利用化学反应或改变溶液pH值，选择性的使被测药物的吸收光谱发生改变，而干扰物质不受化学反应或溶液的pH值改变的影响，吸收光谱保持不变。这样当样品池与参比池装有同样浓度的被测样品溶液时，干扰物的吸收差值总是零，因此测得的A值只与被测物浓度成正比。,举例：差示紫外分光光度法测定血清中苯巴比妥的浓度 仪器UV-120 紫外分光光度计(日本岛津)精取PB 对照品溶于丙二醇-水(64)的溶液中配制成1 mgml-1对照储备液,取储备液配制20、40、60、100、200、400、600、800g-1ml的PB 系列对照溶液备用
9、。a:PB 游离酸 b:PB 单阴离子 c:差示光谱,荧光分光光度法,原理：药物及代谢物在光照射下吸收紫外光或可见光的能量，使外层电子由基态跃迁到较高能级的激发态。当处于激发态的电子又回到基态时，可将这部分能量以光子形式发射出而产生荧光。产生的荧光其能量比吸收光的能量小一些因此荧光的波长比照射光的波长要较长一些。,产生机理有：药物分子直接与斥电子基团(一OH，一NH2或一OCH3)联接有利于荧光的发生，而与吸电子基团(一NO2，一Br一I，一CN或一COOH)联接则使荧光减弱。药物具有可电离的基团联接在共轭系统上，则pH值的选择将影响测定的灵敏度和选择性。如酚类电离成酚盐阴离子，使荧光增强；而
10、芳胺成为芳香铵阳离子可抑制荧光发生。,药物分子结构中共轭体系增加双键，特别是多环芳香结构，可促使荧光增加。药物分子结构中的芳环杂原子(N、S、O属斥电子基)，具有荧光性能，而含-NH2基团的杂环在酸性介质中，由于N的质子化而使荧光强度增加。,药物及代谢物的分子结构不同，所吸收光的波长和发射的荧光波长也有所不同。利用这个待性，可以定性鉴别药物。同一种分子结构的药物及代谢物，吸收同一波长的光，则可发射出相同波长的荧光。若该药物及代谢物的浓度越大，则发射的荧光强度越强。利用这个性质，则可进行体液中药物浓度的定量测定。,荧光法的优点：测定灵敏度高，一般紫外可见分光光度法的灵敏度在10-7g m1，而荧
11、光分光光度法的灵敏度可达10-12gml。虽然能发荧光的物质数量不多，但许多重要的生化物质、药物及其代谢物或致癌物质都有荧光现象。由于荧光衍生化试剂的使用进一步扩大了荧光法的应用范围，因此该法在体内药物分析利药物动力学研究中得到广泛地应用。,基本原理：,荧光是由药物或代谢物等物质在吸收光能之后发射而出，因此溶液的荧光强度和该溶液吸收光能的程度以及溶液中荧光物质的荧光量子效率有关。溶液吸收光能，即被入射光激发后，可以在溶液的各个方向观察荧光强度。由于激发光的一部分被溶液吸收，一部分被透过。因此，在透射光的方向观测荧光是不适宜的，一般是在与激发光源垂直的方向观测荧光的强度。,根据Beer定律推导，
12、在浓度低时，溶液的荧光辐射强度与荧光物质的浓度呈线性关系，可用下式表示：F=kC式中，F为物质的荧光强度；k为常数：C为溶液中荧光物质的浓度。因此，荧光法定量的依据是荧光强度与浓度呈线性关系，实际测定的是荧光强度F。荧光法测定灵敏度取决于检测器的灵敏度，目前所用的荧光检测器即使极微弱的荧光也能测到，可以测定很低浓度的溶液，所以荧光法的灵敏度很高。,荧光法的定量方法 标准曲线法：用已知量的标准物质经过和供试品进行相同的处理之后，配成一系列浓度不问的标准溶液在测定条件相同的情况下分别测定其荧光强度。以标准溶液的浓度为横坐标，以相应的荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。然后在相同条件下测定样品溶液的荧光
13、强度，就可从标准曲线上求出样品溶液的浓度。如果要求精确测定时可用回归直线方程计算样品溶液的浓度。,在制备标准曲线时，常采用标准系列中最大浓度的标准溶液作为基础。将空白溶液的荧光强度读数调至0，将该标准溶液的荧光强度的读数调至100，然后测定标准系列中其他各个标准溶液的荧光强度。为了使在不问时间所绘制的工作曲线能先后一致，在每次测绘标准曲线时均采用同一标准溶液对仪器进行校正。如果样品溶液在紫外光照射下不很稳定，则必须改用另一种稳定，而且其发射光谱与样品溶液的发射光谱相近似的标准溶液作为基础。,对照法：如果荧光的标准曲线通过零点，就可选择其线性范围，用对照法进行测定。通常取已知量的纯净荧光物质，配
14、制一标准溶液，使其浓度在线性范围之间，测定荧光强度Fs，然后在相同条件下测定样品溶液的荧光强度Fx。由标准溶液的浓度和两个溶液的荧光强度比较，求得样品中荧光物质的含量。在空白溶液的荧光强度调不到0时，必须从Fs与Fx值中扣除空白溶液的荧光强度Fo，然后按下式计算：式中，Cx为样品溶液的浓度；C s为标准品溶液的浓度。,荧光分光光度法在体内药物分析中的应用：用荧光分光光度法测量冠心病患者血浆谷胱甘肽,血浆中同时存在GSH 和GSSG半胱氨酸,先直接测血浆中GSH含量,然后在近中性条件下二硫苏糖醇可将GSSG 还原为GSH,再测血浆中GSH 总含量,后者减去前者,即为血浆中GSSG含量。GSH 同
15、时含有伯胺基和硫醇基,在p H 8-10 时,可与邻苯二甲醛的两个醛基缩合成可发强荧光的物质异吲哚。从而运用荧光分光光度仪对血浆中的GSH 进行定量。因一些内源性成分也可与邻苯二甲醛反应生成发荧光的产物,在本实验中,A 管样品用N2乙基马来酰亚胺来封闭GSH 与邻苯二甲醛反应,因而可以认为A 管中的荧光值是由非GSH 产生的,并将A 管作为空白管进行调零。由于在p H 8-10 时,GSSG几乎不与邻苯二甲醛结合产生可发荧光的物质,因而B 管的荧光值(fluorescent unites,FU)反映血浆GSH 的量;而C 管减去B 管所得的FU 则反映血浆中GSSG的量。确定波长，制作GSH
16、和GSSG的标准曲线,喂饲补阳还五汤大鼠血清中黄芪甲甙的固相萃取-化学衍生化-荧光分光光度法测仪器：荧光分光光度计准确移取.mgml-1的黄芪甲甙对照品溶液.ml于5ml干燥容量瓶中,加入2%茴香酸乙醇溶液0.6ml,再加入72%硫酸溶液0.8ml,摇匀,置于60水浴中反应30min.取出冷却至室温,用无水乙醇定容至刻度,摇匀,在RF-5000荧光分光光度计扫描,得黄芪甲甙的激发光谱和发射光谱.如图1.由此确定黄芪甲甙反应产物的最大激发波长310nm,最大发射波长376nm.在此波长条件下,测定黄芪甲甙反应产物的荧光强度值,同时作空白校正.,标准曲线：移取1/ml的黄芪甲甙对照品溶液分别制成0.1,0.2,0.3,0.4,0.8和1/ml的标准系列溶液,各取0.05ml于5ml量瓶中,再分别加入处理的空白血清0.05ml,处理，测定荧光强度，同时作空白校正以荧光强度（Y）对黄芪甲甙浓度(X)进行回归处理,得标准曲线的线性回归方程为Y=20.627X-1.8484,相关系数r=0.9999,线性范围为110 gm1.,
