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1、红细胞计数和血红蛋白测定,概述：血液由血浆和血细胞两部分组成。通过循环系统与全身各个组织器官密切联系参与机体各项生理功能活动，维持机体正常新陈代谢和内环境平衡。在病理情况下，血液系统疾病除直接累及血液外，也可以影响全身组织器官，而各组织器官的病变也可直接或间接地引起学液发生变化，临床上较多的检验项目是通过血液标本的检验来了解机体的变化。,血常规检查（Blood Routine Examination）红细胞计数（RBC）血红蛋白测定（Hb）白细胞计数（WBC）白细胞分类计数（Differential Count，DC）血常规检查对各系统疾病的诊断和鉴别可以提供 许多重要信息，是临床医学检验中最
2、常用，最重 要的基本内容。,红细胞计数与Hb测定 名称 缩写 英文全称红细胞计数 Rbc Red Blood Cell血红蛋白测定 Hb Hemoglobin,一、红细胞基础理论（一）RBC来源、生成、寿命及衰亡 红细胞系祖细胞 早幼、中幼和（BFU-E和FU-E）晚幼各发育阶段 骨髓造血干细胞 骨髓原红细胞（CFU-S）促红细胞生成素 35次分裂（Erythropoietion，EPO）网织红细胞 成熟红细胞从骨髓益出至外周血的全过程约需5天时间一个原红细胞最终可生成816个成熟红细胞红细胞的生存时间为120天 珠蛋白 参与再造血衰亡的RBC 铁 胆红素，参与胆红素代谢,（二）RBC的生理机
3、能（见课件）（三）Hb的组成及结构 珠蛋白（含两对肽链）血红蛋白（Hb）亚铁血红素（Fe+4个卟啉）,22（成人主要 Hb，简称 HbA占 90%）链（141AA）珠蛋白 组合形式 22（成人次要 链（146AA）Hb，HbA2占 13%）22（胎儿主要 Hb，HbF 占2%以 下）,二、红细胞计数（一）原理：用等渗稀释液将血液稀释一定倍数（用已校准的一次性微量采血管或Hb吸管，吸取全血20ul加到3.8ml稀释液内混匀），滴入血细胞计数盘内，然后于显微镜下计数一定范围内的RBC数，经过换算即可求得每升血液中的红细胞数。,（二）试剂 枸橼酸钠（2Na3C6H5O711H2O），3克 甲醛（40
4、%）1ml 以上溶解后加蒸馏水 100ml此配方克服了传统的Hayem液的缺点。（三）操作 见课件,（四）参考值 RBC（1012/L）Hb（g/L）男：4.05.5 120160 女：3.55.0 110150 新生儿：6.07.0 170200,（五）临床意义升高：相对升高与脱水有关（吐、泻、汗、尿、灼、癌）绝对升高与乏氧有关 生理性（高原、胎儿、新生儿、运动、精神因素）病理性（心肺疾患、真性红细胞增多症）降低：生理性降低妊娠、婴幼儿、老年人 病理性降低生成降低、原料不足、造血障碍、丢失增多（失血）、破坏增多（溶血）由于各种病因导致周围血红细胞减少，即病理性贫 血其贫血的病因学分类见第9页
5、“表2-1”,三、血红蛋白测定（一）血红蛋白测定方法改良沙利（Sahli）氏法托尔克维斯脱（Tallgvist）氏法光电比色法硫酸铜溶液比重法酸化（碱化）光电比色法氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定法十二烷基硫酸钠血红蛋白（SDS-Hb）测定法碱羟高铁血红素（AHD-575）法上机分析,（二）氰化高铁血红蛋白（HiCN）法 原理：血红蛋白被高铁氰化钾K3Fe（CN）6氧化成高铁血红蛋白（Hi）再与氰离子（CN-）结合，生成稳定的氰化高铁血红蛋（hemigl-obin Cyanide，简称HiCN）。氰化高铁血红蛋白在波长540nm处有吸收峰，可用校准的高精度分光光度计进行直接定量测定。或用HiC
6、N参考液进行比色测定。,而,幻灯片 12,试剂：常用的Hb转化液为文齐氏液（见实习指导）静置操作：血液20ul+转化液5ml比色 5分钟计算：64458 Hb（g/L）=测定吸光度（A）251 441000=A367.7 64458是目前国际公认的血红蛋白平均分子量 44是1965年国际血液学标准化委员会（ICSH）公布 的血红蛋白摩尔吸光度。251是稀释倍数,（三）注意事项：必须以HiCN法为标准，绘制标准曲线 HiCN试剂不能贮存于塑料瓶中，应放40C冰箱 不能图工作方便不顾质量管理要求 遇到白细胞数过多或异常球蛋白增高的血标本，HiCN比色液会出现浑浊，可离心取上清夜或向比色 液中加少许
7、NaCL（约0.25g）或碳酸钾（0.1g）氰化钾是剧毒品，应妥善保管，配试剂时要按剧毒 品管理程序操作 若用分光光度计作精度定量测定，分光光度计的波 长和吸光度需校正，带宽应小于1nm，比色杯光径 1.00cm，允许误差为0.5%（0.9951.005cm），测 定温度200C250C。,HiCN 参考液的标准（1）波峰540nm1nm，波谷504502nm（2）A540/A504应在1.591.63之间（3）A7500.002（4）棕色容器保存，稳定期长，40C下至少保存6年（5）无菌试验（包括厌氧培养）阴性（6）测定精度 0.1%(7)定值由指定多个参考实验室测定 废液处理（1）按每升H
8、iCN废液加次氯酸钠溶液40ml，充分混匀，敞开容器，置室温3小时。（2）用“84”消毒液40ml代替（3）硷性硫酸亚铁悬液40m/每升HiCN废液,（四）方法学评价 Sahli法 HiCN测定法 操作简便，但误差较大。操作简便，结果稳定可靠。不能转化生理或病理中全 除SHb外，其余各种Hb均可很快地转 部的Hb，对Hbco、Hbred 化为HiCN.转化很慢或转化不完全.Hb转化时间较长，5分钟 HiCN在540nm处吸收峰较宽，可用一 转化88%，10分钟转化95%般分光光度计进行比色。2小时才基本转化完毕。终点反应不明显，比色过 显色快而稳定，因此HiCN液可制成 程不易标准化。在相当长
9、时间（至少6年）内稳定不 变的标准液，这对进行质量控制较为 有利。有摩尔消光系数 可通过分光光度计测定吸光度值 直接计算测定误差小.,SDS-Hb测定法 AHD-575测定法 优点：无剧毒 试剂单一，操作简 操作简单 单，易行，无毒、呈色稳定，可用氯化血 红素作 标准品。缺点：本身质量差 无消光系数 无标准,碱羟高铁血红素（AHD-575）法原理：非离子化去垢剂碱性溶液（AHD试剂）能使血红素，血红蛋白及其衍生物全部转化为一种稳定碱性羟高铁血红素，在575nm处有一特征性的吸收峰。试剂：任选一种转化液 TritonX-100 25g 皂素 1g Brig-35 25g 0.1N NaOH 1000mL 聚乙二醇辛基苯基醚（乳化剂0P）25ml,操作：取血20ul加到上述任一转化液3ml中，充分混匀，静置3分钟，于分光光度计（带宽应小于8nm）波长575 nm处，用光径1.000cm比色杯，以转化液调零，读取吸光度（A）值。计算：64438 Hb（g/L）=测定管吸光度（A）151=A 349.7 6958 4 6958:氯化血红素摩尔消光系数 64458：目前国际公认的血红蛋白分子量 4：一个分子Hb含有4个血红素 151：稀释倍数,THANKS,
