遗传学ppt课件第4章遗传作图.ppt

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1、第4章 遗传作图,4.1 连锁遗传4.2 基因组4.3 遗传标记4.4 RFLP标记4.5 PCR标记4.6 遗传图的构建4.7 基因定位与分子标记辅助选择4.8 原核生物的遗传作图,4.1 连锁遗传,4.1.1 连锁遗传的现象,性状连锁的遗传现象是贝特生（Bateson,W.）等于1905年在香豌豆的两对性状杂交试验中首先发现的。,上述两个试验的结果表明，同一亲本所具有的两对性状，有连系在一起遗传的倾向，这种现象称为连锁（linkage）。,在第一试验中，一亲本的两对基因均为显性，另一亲本的两对基因均为隐性，这样的组合方式称为相引（coupling）。在第二试验中，二个亲本都分别带有一对显性

2、基因和一对隐性基因，这样的组合方式称为相斥（repulsion）。,4.1.2 性状的分解分析第一个试验：紫花:红花=(4831+390):(1338+393)=5221:17313:1长花粉:圆=(4831+393):(1338+390)=5224:17283:1,第二个试验:紫花:红花=(226+95):(97+1)=321:983:1长花粉:圆花粉=(226+97):(95+1)=323:963:1 说明两个单位性状的综合分离不符合独立分配规律，但每个单位性状而言，仍是受分离规律支配的。,4.1.3 连锁遗传的原因与验证 独立分配遗传的前提是F1个体形成的不同配子比例相同。对于2对性状而

3、言，F1产生四种配子，比例为1:1:1:1。如果不是这样，F2就不可能获得原来的理论比例。由此可以推论，在连锁遗传中，F1形成多种的配子不相等。,可用测交法加以验证，因为测交后代的表现型种类及比例就是F1配子的种类及其比例的具体反映。,测交试验 相引相（玉米籽粒遗传）P 有色、饱满 无色、凹陷 CCShSh ccshsh 测交 F1有色、饱满 无色、凹陷 CcShsh ccshsh 配子 CSh Csh cSh csh csh 总数测交子代(Ft)CcShsh Ccshsh ccShsh ccshsh 有色、饱满 有、凹 无、饱 无色、凹陷实得粒数 4032 149 152 4035 8368

4、百分比%48.2 1.8 1.8 48.2,亲本组合=(4032+4035)/8368 100%=96.4%,重新组合=(149+152)/8368 100%=3.6%,结论:F1不同类型配子的比例 CSh:Csh:cSh:csh=48.2:1.8:1.8:48.21:1:1:1 说明两对非等位基因不是独立分配的,而常常是连系在一起遗传,导致亲本型的配子数偏多,而重新组合偏少。,相斥相 P 有色、凹陷 无色、饱满 CCshsh ccShSh 测交 F1有、饱 无、凹 CcShsh ccshsh 配子 CSh Csh cSh csh csh 总数测交子代(F1)CcShsh Ccshsh ccS

5、hsh ccshsh 有、饱 有、凹 无、饱 无、凹实得粒数 638 21379 21096 672 43785百分比%1.5 48.5 48.5 1.5,亲本组合=(21379+21096)/43785 100%=97.01%重新组合=(638+672)/43785 100%=2.99%结论:F1不同类型配子的比例 Csh:CSh:csh:cSh=48.2:1.8:1.8:48.21:1:1:1 说明两对非等位基因不是独立分配的,而常常是连系在一起遗传,导致亲本型的配子数偏多,而重新组合偏少。,4.1.4 重组率(percentage of recombination)上述结果均说明重组型配

6、子百分率 50%。重组型的配子百分数称为重组率。重组率通常是通过测交后代出现的重组型个体的多少来计算。在测交后代中，重组率可以用重组型个体数占个体总数的百分率来计算。,重组型配子数 重组率（%）100 配子总数,重组型个体数 重组率（%）100 测交子代的个体总数,理论上，重组率的变动范围在0-50%之间。当重组率为0时，说明两对基因之间不发生换，为完全连锁。,当重组率为50%时，两对基因服从独立分配，不存在连锁关系。当0 重组率50%时，两对基因为不完全连锁。,连锁的本质 Bateson发现连锁遗传现象不久，Morgan用果蝇为材料，证明:具有连锁关系的基因位于同一染色体上,4.1.5 完全

7、连锁和不完全连锁(1)完全连锁（complete linkage）在同一同源染色体上的两个非等位基因总是连系在一起而遗传的现象。F1自交或测交，其后代个体的表现型只表现为亲本组合的类型。完全连锁后代的表现与一对基因的遗传很近似，即自交结果为3:1分离,测交结果为1:1分离。,完全连锁遗传的自交后代和测交后代的比较,(2)不完全连锁（incomplete linkage）是指同一同源染色体上的两个非等位基因并不总是连系在一起遗传的现象，测交后代中大部分为亲本类型，少部分为重组类型的现象。不完全连锁F1不仅产生亲型配子，也产生重组型配子。,4.1.6 交换与不完全连锁的形成问题提出：重组型的配子如

8、何产生的？为什么 重组率总是少于50%？回答这些问题，就必须从减数分裂过程中非姊妹染色单体之间发生的交换谈起。,Sh C,sh c,二分体,Sh C,Sh C,Sh C,Sh C,Sh C,sh c,sh c,sh c,sh c,sh c,sh C,Sh c,C Sh,C Sh,C Sh,c Sh,C sh,c sh,c sh,c sh,四分体,全部亲本型,1/2亲型 1/2重组型,F1,交换,交换,F1,新,新,新,由于发生了交换而引起同染色体间非等位基因的重组，打破原有的连锁关系，因而表现出不完全连锁。,所谓交换，是指同源染色体的非姊妹染色单体之间的对应片段的交换，从而引起相应基因间的交换

9、与重组。,交换都发生在同源染色体相靠近的非姊妹染色体之间，而另外两条不交换。一部分染色体交换发生在连锁基因之内，重组配子 1/2重组、1/2亲型配子 另一部分交换发生在连锁基因之外，非重组配子 所以重组型配子自然少于50%,举例：假定在杂种的100个孢母细胞内，有 7个交换发生在基因之内，其他93个交换发生在两连锁基因之外，交换后的情况见表。,Sh C,Sh c,亲本型配子 重组型配子 总配子数 CSh csh Csh cSh93个孢母细胞在连锁 186 186 区段内不发生交换 93 4=372个配子7个孢母细胞在连锁 7 7 7 7 区内发生交换 7 4=28个配子 400 193 193

10、 7 7,亲本组合=（193+193）/400 100%=96.5%重新组合=（7+7）/400 100%=3.5%,重组率（3.5%）等于发生基因之内交换的孢母细胞的百分数一半。,4.1.7 连锁遗传的细胞学基础,在减数分裂过程中，位于同一染色体上距离靠近的两个基因，在基因分离时有保持在一起的倾向;同一染色体上两个基因发生的部分连锁是减数分裂过程通过出现交换使它们彼此分开的结果;,由于交换发生在同源染色体的两个非姐妹染色单体之间，因此任何一个交换只涉及一对同源染色体上4条染色单体中的两条染色单体，所以重组型配子自然少于50%。,4.1.8 连锁群 根据连锁遗传的关系，一个生物的一系列基因座位

11、可以划分为若干个连锁群（linkage group）：在染色体中具有不同的连锁程度并按线性顺序排列的一组基因座位。,基因座位的连锁关系可以通过重组率来分析。一个生物连锁群的数目通常与染色体的对数是一致的，即与二倍体生物中的单倍体染色体数目相同。,4.1.9 性别决定与性连锁,（1）性染色体与性别决定 性染色体：生物染色体可以分为两类*性染色体：直接与性别决定有关的一个或一对染色体。性染色体如果是成对的，则往往是异型的，即形态、结构和大小以及功能都有所不同。*常染色体：其它各对染色体，通常以A表示。常染色体的各对同源染色体一般都是同型的，即形态、结构和大小基本相同。,如：果蝇 n=4雌3AA+1

12、XX 雄3AA+1XY,性别决定的方式:由性染色体决定雌雄性别的方式主要有：(1)雄杂合型：*XY型：果蝇、人(n=23)、牛、羊、*X0型：蝗虫、蟋蟀，雄只有1个X、不成对；(2)雌杂合型：*ZW型：家蚕(n=28)、鸟类（包括鸡、鸭等)、鹅类、蝶类等；(3)雌雄决定于倍数性：如蜜蜂、蚂蚁：正常受精卵 2n为雌、孤雌生殖 n为雄。,性别决定的畸变性别决定也有一些畸变现象，通常是由于性染色体的增减而破坏了性染色体与常染色体两者正常的平衡关系而引起的：如：蜜蜂、蚂蚁：n=雄性、2n=雌性。,植物的性别决定 植物的性别不象动物一样明显：*种子植物虽有雌雄性别的不同，但多数为雌雄同花、雌雄同株异花；

13、*有些植物属于雌雄异株，如大麻、菠菜、蛇麻、番木瓜、石刁柏、银杏等。,其中：蛇麻、菠菜：雌XX，雄XY；银杏（见下图）：雌ZW，雄ZZ。,玉米是雌雄同株异花植物，其性别决定是受基因支配。ba 基因可使植株无雌穗，只有雄穗；ts 基因可使植株的雄花序 雌花序，并能结实。*因此基因型不同，植株花序也不同：(1).Ba_Ts_ 正常雌雄同株(2).Ba_tsts 顶端和叶腋都生长雌花序(3).babaTs_ 仅有雄花序(4).babatsts 仅顶端有雌花序babatsts()babaTsts()(仅有雄花序)babaTsts:babatsts(顶端有雌花序)1:1玉米雄穗上长果穗,环境对性别分化的

14、影响 营养条件：如蜜蜂 雌蜂(2n)蜂王浆 蜂王(有产卵能力)雌蜂(2n)普通营养 普通蜂(无产卵能力)孤雌生殖 雄蜂(n),激素：如母鸡打啼 母鸡卵巢退化，促使精巢发育并分泌出雄性激素，但其性染色体仍是ZW型。,氮素影响：早期发育时使用较多N肥或缩短光照时间，可提高黄瓜的雌花数量。温度、光照：降低夜间温度，可增加南瓜的雌花数量；缩短光照 增加雌花。总之：*性别受遗传物质控制：*有的通过性染色体的组成有的是通过性染色体与常染色体二者之间的平衡关系有的通过染色体的倍数性 环境条件可以影响甚至转变性别，但不会改变原来决定性别的遗传物质。*环境影响性别的转变，主要是性别有向两性发育的特点（如下图玉米

15、雌雄穗的形成)；,（2）性连锁,摩尔根等人(1910)以果蝇为材料进行试验时发现性连锁现象。性连锁(sex linkage)是指性染色体上基因所控制的某些性状总是伴随性别而遗传的现象，所以又称伴性遗传(sex-linked inheritance)。,果蝇眼色的遗传：摩尔根等在纯种红眼果蝇的群体中发现个别白眼个体（突变产生）。雌性红眼果蝇雄性白眼果蝇杂交 F1全是红眼 近亲繁殖产生的F2既有红眼，又有白眼，比例是3:1（一对基因的差异）F2群体中白眼果蝇都是雄性而无雌性，这就是说白眼这个性状的遗传，是与雄性相联系的，同X染色体的遗传方式相似。假设：果蝇的白眼基因在X性染色体上，而Y染色体上不含

16、有它的等位基因，上述遗传现象可以得到合理解释。,2.人类的性连锁：如色盲、A型血友病等就表现为性连锁遗传。下面以色盲(红绿色盲)的性连锁为例来说明。,(1).已知控制色盲的基因为隐性c位于X染色体上，Y染色体上不带它的等位基因；(2).由于色盲基因存在于X染色体上，女人在基因杂合仍是正常的，而男人的Y基因上不带其对应的基因，故男人色盲的频率高。女：XCXc杂合时非色盲，只有XcXc纯合时才是色盲；男：Y染色体上不携带对应基因，XCY正常、XcY色盲。请看下图：人类不同婚配下色盲遗传的情况,3.芦花鸡的毛色遗传:芦花基因B为显性，正常基因b为隐性，位于Z性染色体上。W染色体上不带它的等位基因。雄

17、鸡为ZZ，雌鸡为ZW。,限性遗传(sex-limited inheritance)：是指位于Y染色体(XY型)或W染色体(ZW型)上的基因所控制的遗传性状只局限在雄性或雌性上表现的现象。限性遗传的性状多与性激素的存在有关。例如，哺乳动物的雌性个体具有发达的乳房，某种甲虫的雄性有角等等限性遗传与伴性遗传的区别：限性遗传只局限在一种性别上表现，而伴性遗传则可在雄性也可在雌性上表现，只是表现频率有所差别。从性遗传（sex-controlled inheritance)或称性影响遗传(sex-influenced inheritance)：其与限性遗传不同,是指不含于X或Y染色体上基因所控制的性状表现

18、，而是因为内分泌及其他关系使某些性状或只出现于雌雄一方；或在一方为显性，另一方为隐性的现象。例如，羊的有角因品种不同而有三种特征：.雌雄都无角，.雌雄都有角，.雌无角而雄有角。以前两种交配，其F1雌性无角，而雄性有角。反交的结果和正交的完全相同。,4.2 基因组,单基因,多基因,基因组（genome）基因整体。,独立遗传,基因互作,连锁遗传,连锁群,http:/,TAIR SeqViewer Whole Genome View,http:/,4.2.1 原核生物与真核生物,原核细胞与真核细胞的主要区别在于细胞核的结构。原核细胞缺少核膜，也缺少细胞器以及真核细胞所具有的细胞结构。,4.2.2 基

19、因组的类型和大小,(1)原核生物的基因组 大多数原核生物的基因组小于5 Mb，比真核生物的基因组小得多。典型原核生物的基因组一般含有单一的DNA分子，呈环状，位于拟核（nucleoid）区内。原核生物还可能含有更小的质粒（plasmid）的DNA分子。,生物 基因组大小（Mb）原核生物Mycoplasma genitalium 0.58Escherichia coli 4.64Bacillus megaterium 30真核生物 真菌 Saccharomyces cerevisiae（酵母）12.1Aspergillus nidulans 25.4 原生动物Tetrahymena pyrifo

20、rmis 190 无脊椎动物Drosophila melanogaster（果蝇）100 Bombyx mori（蚕）490Locusta migratoria（蝗虫）5,000 脊椎动物Fugu rubripes（河豚）400Homo sapiens（人类）3,000Mus musculus（鼠）3,300 植物Arabidopsis thaliana（拟南芥）100Oryza sativa（水稻）565Zea mays（玉米）5,000Triticum aestivum（小麦）17,000Fritillaria assyriaca（贝母）120,000,不同生物类型基因组的大小,资料来源：

21、Brown T.A.,1999。,（2）真核生物的细胞核基因组 真核生物细胞核基因组的大小从小于10 Mb到大于100,000 Mb。基因组的大小一般与生物的复杂性相一致，高等真核生物的基因组一般大于低等真核生物的基因组。但基因组的大小不但决定于基因组中基因的数目，而且也与重复DNA的量有关。真核生物的细胞核基因组由一组线性DNA分子组成，每一DNA分子包含在一条染色体中。,（3）真核生物的细胞器基因组 真核生物都有线粒体基因组。所有的光合真核生物都有叶绿体基因组。大多数的线粒体和叶绿体基因组都是环状的，但在很多的真核生物，细胞器中环状基因组是与它的线状版本同时存在的。细胞器基因组的拷贝数还不

22、是十分清楚。,线粒体基因组的大小变化较大，而且与生物的复杂性无关。大多数多细胞动物具有较小的线粒体基因组，如人的线粒体基因组只有16569 bp。较低等的真核生物和显花植物含有较大的线粒体基因组。叶绿体基因组的大小变化不大。,不同生物线粒体和叶绿体基因组的大小,物种 生物类型 基因组大小（kb）A.线粒体基因组 Chlamydomonas reinhardtii 绿藻 16 Mus musculus 脊椎动物（鼠）16 Homo sapiens 脊椎动物（人类）17 Drosophila melanogaater 脊椎动物（果蝇）19 Chondrus crispus 红藻 26 Saccha

23、romyces cerevisiae 酵母 75 Brassica oleracea 显花植物（甘蓝）160 Arabidopsis thaliana 显花植物（拟南芥）367 Zea mays 显花植物（玉米）570 Cucumis melo 显花植物（甜瓜）2500B.叶绿体基因组 Pisum sativum 显花植物（豌豆）120 Oryza sativa 显花植物（水稻）136 Nicotiana tabacum 显花植物（烟草）156 Chlamydomonas reinhartii 绿藻 195,（资料来源：Brown T.A.,1999）,基因组学(1)由来 1909年，Joha

24、nnsen提出了“基因”（gene）一词;1920年，H.Winkler提出了“基因组”（genome）一词，用以代表一个生物的一组染色体所包含的全部基因;1953年，DNA双螺旋结构发现后，使基因组的研究从染色体水平进入了分子水平，推动了基因组研究的发展;1986年，美国的H.Roderick提出了“基因组学”genomics一词，从此基因组学正式成为一门科学。,(2)概念 基因组学是研究生物基因组的结构和功能的科学。结构基因组学（structural genomics）:主要研究基因组的结构。确定基因在染色体上的位置，并测定基因中核苷酸序列。功能基因组学（functional genomi

25、cs）,后基因组学（post-genomics）:主要研究基因组的功能。确定基因功能及其作用机制，分析基因表达特征。进化基因组学（evolutionary genomics）：以进化生物学的手段注释基因组；通过比较基因组研究探索基因组的进化过程和规律。,基因组作图（genome mapping）是结构基因组学的主要任务。遗传作图（genetic mapping）、物理作图（physical mapping）序列作图（sequence mapping）或称基因组测序（genome sequencing）。,4.3 遗传标记,1.遗传标记的基本特征 遗传标记（genetic marker）指可追踪

26、染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征：可识别性，亲本间存在着多态性和可遗传性，亲本间存在的多态性在后代中可以重演。因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。,遗传标记包括 形态标记（morphological marker）细胞学标记(cytological marker)生化标记(biochemical marker)(DNA)分子标记(molecular marker),2.形态标记,形态标记是指以生物体的形态性状为特征的遗传标记。这类遗传标记一般可以通过肉眼观察到，因此这类标记又称为可见标记。从广义来讲，形态标记还包括与生物的生

27、理特性、抗病性和抗虫性等有关的标记。形态标记是最早利用的遗传标记。,水稻部分形态标记及标记基因,形态标记鉴定识别简便，但数量少，难以建立饱和的遗传图谱，且受环境、生育期等因素的影响。,3.细胞学标记,细胞学标记:能明确显示遗传多态性的细胞学特征。最常见的为染色体的形态特征，主要包括结构特征和数量特征。这类遗传标记通常在显微镜下才能观察到。,染色体的结构特征 带纹,重复与缺失,染色体的结构特征重复、缺失、倒位、易位,染色体的数量特征 缺体、单体、三体、四体,水稻IR36初级三体的形态特征,细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点，但其产生需要花费大量的人力物力进行培育；有些物种对染色体结构和数

28、量变异的耐受性较差，难以获得相应的标记材料；有些标记伴有对生物有害的表型效应；还有些标记的鉴定比较困难。,4.生化标记 主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，通过电泳带型成为可利用的遗传标记。（等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。）,生化标记是基因表达的产物，与形态和细胞学特征相比，数量上更丰富，受环境影响更小。但蛋白质标记仍然存在一些不足，如每一种同工酶标记都需要特殊的显色方法；某些酶的活性具有发育和组织特性；而数量有限是其关键不足。,5.DNA标记：指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，这种标记可能包含基因本

29、身，也可能是与该基因紧密连锁的附近DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。即以特定的DNA片段作为某基因的遗传标记。,结构基因,DNA分子标记,DNA标记具有以下的优势：（1）DNA标记的数量理论上是无限的；（2）DNA标记具有很高的稳定性，不易受环境的影响，且在个体的不同组织器官和不同的发育时期表现一致；（3）DNA标记的多态性程度较高，等位基因较多，且多数标记类型表现为共显性；（4）DNA标记对生物体本身通常是无害的，因此具有较大的选择余地。,4.4 RFLP标记（第一代分子标记）(Restriction Fragment Length Polymorphisms),限制性片段长度多态

30、性分析是一个较复杂的过程，包括限制性酶的利用、限制性片段的电泳分离和DNA杂交等多个环节。,1.限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）限制酶（restriction enzyme）：一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。限制位点（restriction site）：特定限制酶所具有的特异识别的DNA序列。粘性末端（cohesive end）：DNA经限制酶切开后产生的一种交错切口。,一些限制性内切酶的特性 酶名称 酶来源的生物 识别序列和切点位置 DNA中切割位点的数目 pBR322Bam HI Bacillus a

31、myloliquefaciens H5 G GATCC 3 5 1 3 CCTAG G 5Bgl IIBacillus globigiA GATCT 5 0 TCTAG AEco RIE.coli RY 13 G AATTC 5 1 CTTAA GHind IIIHaemophilus influenzae RdA AGCTT 6 1 TTCGA APst IProvidencia stuartiiCTGCA G 18 1 G ACGTCSal I Streptomyces albus G G TCGAC 2 1 CAGCT G,2.限制性片段的电泳分离,两个限制位点之间的DNA片段，称为限制

32、性片段。,基因组DNA经限制酶酶切后产生大量的限制性片段，这些片段长度不一，根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所携带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将核酸等分子混合物中的各种成分彼此分离开来。,凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关.在RFLP分析中，经限制酶酶切后产生的DNA片段，其大小主要集中在1-10 kb 的范围内，因此DNA片段的分离，通常选用琼脂糖凝胶进行，其浓度一般为1.0%左右。,凝胶类型 浓度（%）分离DNA片段的大小范围（bp）琼脂糖 0.3 50,000-1,000 0.7 20,000-1,000 1.4 6,000-300聚丙烯酰胺 4.0 1,000-100 1

33、0.0 500-25 20.0 50-1资料来源：吴乃虎，1998。,不同凝胶类型和浓度与分离DNA片段大小的范围,3.DNA杂交 DNA杂交（DNA hybridization）是限制性片段长度多态性分析中的一种多态性检测技术。,(1)核酸杂交 变性（denaturation）与复性（renaturation）;由两条单链核酸分子结合成为双链核酸分子的过程，称为核酸杂交。任何两条单链核酸分子只要大部分的碱基序列互补，都可以结合为双链分子。通过核酸杂交形成的双链分子，称为杂交分子。通过核酸的互补序列可检测复杂混合物中特定的DNA或RNA序列。,(2)探针（probe）探针是一种DNA或RNA分

34、子，可用于检测具有互补序列的核酸。探针必须用能够检测的试剂所标记。标记主要有放谢性同位素和非放谢性同位素系统。RFLP分析中所用的探针，通常为某一DNA片段，其长度一般为0.5-2.5 kb。,(3)Southern印迹 Southern印迹（blotting）是以核酸杂交为基础发展而来的一个分析技术，它是以发明者牛津大学的Southern的名字来命名的。Southern印迹技术是为DNA杂交服务的。,第一步：产生和分离限制性片段。第二步：凝胶上已变性的DNA片段转移到尼龙膜（或硝酸纤维膜）上，以便于DNA杂交。第三步：使探针与膜上具有互补序列的DNA片段结合，形成杂交分子。,A琼脂糖凝胶电泳

35、,D放射自显影,CDNA杂交,B毛细管印迹,4.RFLP标记的遗传,限制性片段长度的差异称为限制性片段长度多态性可以反映DNA序列的差异。,限制性片段长度多态性（RFLP）标记的遗传,RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。,4.5 PCR标记（第二代分子标记）1985年，Mullis等人首创了一种称为聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，缩写成PCR）的体外DNA扩增

36、（amplification）技术。利用PCR技术，可以对染色体上某一DNA序列，在简单的酶促反应中进行扩增，以便对扩增片段进行分析。,1.PCR技术(1)PCR的基本原理 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。模板DNA在高温下解链成为单链模板，人工合成的寡核苷酸引物在低温条件下与模板DNA链互补结合，DNA聚合酶在适温条件下将单核苷酸从引物3端开始掺入，沿模板53方向延伸，合成DNA新链。,PCRDNA复制的原理,(2)PCR的反应条件 PCR的反应过程由高温变性、低温退火及适温延伸三个阶段组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：高温变性：置待扩增DNA于高

37、温下解链成为单链模板。低温退火：人工合成的两个寡聚核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合。适温延伸：DNA聚合酶在72C将单核苷酸从引物3端开始掺入，沿模板53方向延伸，合成DNA新链。,由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经过25-30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上至少可扩增105，一般可106-107。,2.RAPD标记（randomly amplified polymorphic DNA，缩写成 RAPD，读作“rapid”）Williams 等于1990年首创。RAPD的基本程序是PCR反应，所用的反应条件与常规

38、PCR基本一致。RAPD的每个反应只需要一个引物，引物的长度为10个核苷酸（较短）。RAPD扩增产物是相同引物在DNA双链结合点之间的片段。多态性通常表现为有带和无带的差异，即显性效应。,特定引物结合区发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,特定引物结合位点分布发生变化,PCR产物增加、缺少,显性标记,RAPD的检测与一般的PCR相同。RAPD的带型通常为显性。,随机引物BA 2142扩增的RAPD 条带1.KDNAE coR+Hind;2 6.冬油菜(依次为宁强毕家油菜,关中油白菜,太谷油菜,息县黑油菜,河南红);7 14.南方油白菜(依次为横峰油菜,慈利白油菜,会同甜油菜,苏州藏菜,万安油菜,

39、蒙自黑油菜,黄冈白油菜,翁安白油菜);15 21.春油菜(依次为武威小油菜,显龙油菜,榆中油菜,宁交5号,浩油11号,门源小油菜,青海大黄油菜),RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低；（6）共迁移问题。,3.微卫星标记（1）微卫星序列 真核基因组中存在的重复单元为1-6个核苷酸，由10-50个重复单元串联组成的重复序列。一般称为简单序列重复（simple sequ

40、ence repeat，缩写成SSR）或简单串联重复（simple tandem repeat，缩写成STR）。又由于其重复单元小，长度短，其GC含量偏离基因组平均值，被称为微卫星序列（microsatellite）。,（2）由于重复单元的不同，微卫星存在着多种不同的类型 在人类基因组中，最丰富的微卫星是(AC)n和(GA)n。(AT)n是植物基因组中最丰富的微卫星。,在水稻基因组中，最丰富的微卫星是(AT)n和(AG)n,Frequency of the ten most frequent SSR motif families in the rice genome(IRGSP，2005),（

41、3）微卫星标记的产生 由于不同基因型在简单序列的重复次数不同，当对微卫星序列进行扩增时，很容易出现扩增片段长度的多态性，这种现象称为简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，缩写成SSLP)。,GCTGTACAGTGTCTTCGTTTC,TGCCTATTGCCTACTCACTC,TSA,CB,Marker,RM1068,F2 Population,TSA籼稻,CB粳稻,重复12次,重复20次,GCTGTACAGTGTCTTCGTTTC,TGCCTATTGCCTACTCACTC,SSR标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）

42、具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）方法简单、快捷、实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此对一些植物，其开发有一定困难，费用也较高。,水稻Wx基因的复等位基因,几种分子标记特点的比较标记类型 带型等位基因数 杂合度 稳定性 技术难度 费用RFLP 共显性 中(4.8)0.63 高 难 高RAPD 显性 少(2.0)0.36 低 易 低SSR 共显性 多(6.8)0.72 高 易 低注：表中数字来自Pejic I.,etal.,TAG(1998)97:1248-1255.,4.分子标记技术发展PCR技术与限制性酶切技术

43、结合 CAPS：特异性PCR限制性酶切电泳 AFLP：限制性双酶切选择性PCR 电泳电泳操作过渡到基因芯片等不依赖电泳的自动操作 SNP标记（第三代分子标记）依据已克隆基因序列设计引物 功能性标记,第一代：RFLP第二代：RAPD、SSR等第三代：SNP,形态标记和同工酶标记通常本身就是具有某种功能的基因，但细胞学标记和DNA标记通常主要起标记的作用。随着遗传学的不断发展，遗传标记与基因将在DNA水平上整合在一起，基因具有遗传标记的作用，而遗传标记也具有基因的功能，这样就可以通过容易识别的遗传标记直接找到所需要的基因。,4.6 遗传图的构建,每个基因在染色体上通常有固定的座位（locus）。遗

44、传作图的主要任务就是要测定基因座位在染色体上的排列顺序和相互间的遗传距离。大多数基因很难直接识别，因此通常利用容易识别的遗传标记来构建遗传图，把基因组的“版图”测绘出来，以便通过遗传图从基因组中找到所需要的基因。,1.连锁分析(1)两点测验,两点测验（two-point testcross）是测定标记间距离的基本方法。这种方法是通过一次测交来确定两个标记之间的重组率。两点测验只能测定两标记之间的距离，但不能确定标记的排列顺序。,(红眼大翅),突变型,X X,X Y,在2441只F2果蝇中，900只（36.9%）表现为重组的表现型。由此计算出果蝇白眼（w）和小翅（m）两个基因之间的重组率为36.

45、9%。,(2)三点测验,通过一次杂交和一次用隐性亲本测交，同时确定三次基因之间的遗传距离和排列顺序的方法。可达到二个目的：纠正两点测验的缺点，使估算的交换值更加准确；二是通过一次试验同时确定三对连锁基因的位置。,（3）基本原理 根据亲本基因型，判断F1的基因型，罗列出三对基因可能的排列顺序；然后分析可能发生的交换及所产生的基因型（3对基因之间可能只发生一次交换，也可能发生二次交换（即双交换double crossing over）,发生二次交换的可能性肯定是较少的）；再根据双交换产生的个体的基因型推出亲本的基因排列，确定三对基因的排列顺序。,Sh WX C,sh wx c,Sh WX C,sh

46、 wx c,Sh WX C,sh wx c,单交换,双交换,基因位置排定后，进一步估算交换值，以确定它们的距离。值得注意的是每个双交换都包括两个单交换，所以在估算两个单交换值时，应该分别加上双交换值，才能正确反映实际发生的单交换频率。,举例：玉米Cc、Shsh和Wxwx三对基因的定位 杂交和测交结果见下表,、判断这三对基因是不是独立遗传 如果是:测交后代八种表现型比例彼此相等，仅为一类比例。结果:不等(差别很大)独立遗传,B、判断是否为二对基因连锁(位于同一条染色体上)，一对独立(即位于另一条染色体上)如果是:测交后代八种表现型就应该每四种表现型的比例一样,总共只有两类比例值。二对连锁基因产生

47、F1配子比例a:b:b:a,另一对基因是独立的,所以八种配子的比例为(a:b:b:a)(1:1)=a:b:b:a:a:b:b:a。结果：不是。确定为三对连锁遗传,C、找出两种亲本表现型和两种双交换表现型，并写出F1和两种双交换配子的基因型 产生配子 饱满、糯性、无色+wx c+wx c亲型 F1 凹陷、非糯性、有色 sh+sh+饱满、非糯性、有色+双交换型 凹陷、糯性、无色 sh wx c,D、对F1基因型基因顺序进行可能的排列+wx c wx+c wx c+sh+sh+sh,E、对三种排列的基因型进行双交换观察,看哪一种排列双交换后将产生 sh wx c和+的配子 从“D”推断可得知只有 才

48、能产生 sh wx c 和+双交换的配子 所以基因排列顺序为wx sh c 或c sh wx，即sh位于wx和c中间。,+sh+,wx+c,F、计算wx和sh,sh和c之间的交换值 双交换值=(4+2)/6708100%=0.09%wx和sh间的单交换值=(626+601)/6708 100%=17.5%wx+c+c wx sh+sh+,wx和sh间的实际单交换值,=17.5%0.09%=18.4%,sh和c间的单交换值=(113+116)/6708 100%=2.41%wx+c wx+sh c+sh+,sh和c间的实际单交换值,=2.41%+0.09%=3.5%,这样，三对基因在染色体上的位

49、置和距离可以确定如下:21.9 18.4 3.5 wx sh c,2.交换干扰与作图函数(1)交换干扰 随着染色体上两标记间距离的增加，两标记座位之间发生双交换的可能性就越大。如果各个交换事件是独立的，根据概率定律，双交换出现的频率就应等于两个单交换频率的乘积。,干扰 即一个单交换发生后,在它邻近再发生第二个单交换的机会就会减少。例：上例理论双交换值=0.1840.035=0.64%而实际双交换值（由重组推算的）只有0.09%,所以出现干扰现象。,符合系数 对于受到干扰的程度，通常用符合系数来表示。符合系数（C）=实际双交换值/理论双交换值 例：上例的符合系数=0.09/0.64=0.14,干

50、扰值I=1-C 当I=0时，没有干扰，C=1。当I=1时，则没有双交换发生,发生完全干扰。大多数情况下0I1。但在一些特殊情况下，实际观察值比理论值大，称为负干扰，即一个单交换发生可提高另一单交换发生的频率。,(2)作图函数,计算两个相距较远的基因座之间的图距时，如果中间没有其他基因座可用，则两个基因座之间实际发生的双交换就不能被鉴定出来。而由于双交换的结果，会使根据重组值估计的两个基因座位间的距离估计值偏低。因此，采用一些数学的方法矫正。,作图函数（mapping function）:真实的遗传图距与重组率之间的函数关系。图距单位（map unit）通常为厘摩（centiMorgan，缩写成