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1、（Techniques of Molecular Markers）,分子标记技术,课程基本情况:,教学目的:使学生了解以Souther blot、PCR为基础,能用于遗传多样性研究的分子标记技术,包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISH、DDRT-PCR、SNP 等.教学内容及基本要求:DNA结构与功能；PCR技术；各种分子标记技术 基本原理；各种分子标记技术基本操作方法；分子标记技术的应用；实验中经常遇到的问题及解决方法。教学目标：使学生掌握常见分子标记技术使用的基本技能。学习本课程的前期课程要求:遗传学、细胞生物学、分子生物学.教 材:郑成木 主编.植物分子标记原理与方法.湖南科技
2、出版社,2002年5月 考核：写一份读书报告，并做成PPT进行讲解。,何谓读书报告，就是读完书之后的心得报告，是阅读者系统的收集、统整、研读与创作主题相关的各种材料，经分析、归纳、提炼等思维活动，提出个人见解和观点的文字作品。写读书报告的目的在于增加新知、提升研究和表达能力。,第一章 绪论,1.1 遗传标记的类型及发展1.2 遗传物质DNA1.3 聚合酶链式反应PCR1.4 分子标记常用技术概述,1.1 遗传标记的类型及发展,A genetic marker is any difference in DNA,no matter how it is detected,whose pattern
3、of transmission from generation to generation can be detected.,Genetic marker that are detected by direct analysis of the DNA are called DNA markers.,1.1 遗传标记的类型及发展,遗传标记(genetic markers)是研究生物遗传变异规律及其物质基础的重要手段。遗传标记主要有4种类型:形态标记（morphological markers）细胞学标记（cytological markers）生化标记（biochemical markers）分
4、子标记（molecular markers）在植物遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以下几个条件：（1）多态性高；（2）表现共显性；（3）对农艺性状影响小；（4）经济方便，容易观察记载。,多态性：群体内存在着和等位基因相关的若干种表现型，是单一基因座等位基因变异性在群体水平的体现。遗传多态性发生于基因组群体内，表现出由于等位基因受影响而产生不同的基因型，由此产生个体之间的多态性。HLA基因多态性：人类白细胞抗原（HLA）的主要功能是参与自我识别、免疫调节和对异体移植物排斥反应。HLA-DRB1基因是最具多态性的基因，存在106个等位基因，尤其是外显子2处含有多达40个等位基因，最常见的有1
5、6个等位基因位点，此处含有与某些疾病的易感基因和保护基因。共显性：杂合子的一对等位基因各自都具有自己的表型效应，当这一对等位基因杂合时，两种表现型共存。便于鉴别基因的 纯合或杂合。,形态标记（morphological markers）,形态标记即植物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：株高、穗长、粒色、花色、粒重等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。1864年，孟德尔以豌豆的花色、种子形状、子叶颜色、豆荚形状、豆荚颜色、花序着生部位和株高7个不同的形态标记为对象，进行豌豆杂交试验，对杂交后代进行分析研究，得出了著名的分离和独立分配规律。,形态标记简单直观、
6、经济方便；但其数量在多数植物中是很有限的，且多态性较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此,形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。,细胞学标记（cytological markers）,细胞学标记即植物细胞染色体的变异。各个物种的染色体都有特定的特征。包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化 与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还
7、有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此，到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。,染色体显带（chromosome banding）：借助于特殊的处理程序，使染色体显出深浅不同的带纹。染色体的数目、位置、宽窄与浓淡具有相对的稳定性。染色体带型分析：通过蛋白酶或酸、碱、盐等化学因素或温度变化等物理因素处理染色体，然后用Giemsa、芥子喹吖因等染料进行染色，可使各对染色体上表现出不同的染色带型或荧光域，因而可以在经典的核型分析的基础上，进一步根据染色体的带型更精细地分析染色体。,生化标记（biochemical markers）,生化标记主要包括同工酶和等位酶标记,同工酶是指
8、一个以上基因座位编码的酶的不同形式;等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，同时有组织特异性和发育时期特异性。且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。,同工酶与等位酶电泳可区分的同一种酶（系统）的不同变化。,同工酶(isozyme)：广义是指生物体内催化相同反应而
9、分子结构不同的酶。催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。等位酶(allozyme)：由同一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同。,同工酶与等位酶,材料的采集,研磨和酶的提取,酶的保存,凝胶制备,电泳,凝胶切片,酶的组织化学染色,酶谱的记录与分析,数据分析,同工酶与等位酶,分析的过程,同工酶与等位酶,酶谱照片,在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。例如最原始的脊椎动物七鳃鳗（Lamprey）只有一种LDH肽链，进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链。又如通过对地理分布不同的
10、物种间某一同工酶谱的普查可以推测物种的地理来源、分类等。动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用同工酶谱的比较来确定。在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。,酶是基因表达的直接产物，同工酶谱的器官组织特异性也反映了基因表达的特异性。目前与性别分化有关的同工酶研究大多集中在过氧化物酶同工酶在雌雄器官中的差异研究。早在1972年，Penel等就注意到菠菜的性别差异与过氧化物酶同工酶谱带的数目有关。沈德绪认为葡萄和中华猕猴桃中雌株酶带数
11、也比雄株多。范双喜等对芦笋雌雄株过氧化物酶同工酶(POD)进行了研究，结果表明雄株均比相应的雌株少一条酶带，说明芦笋性别差异与过氧化物酶同工酶谱带的数目有关，过氧化物酶同工酶谱的差异可以作为性别鉴定的指标。另外在杨梅、猕猴桃等中也有过类似的报道。应振士等分析认为，过氧化物同工酶与雌性相关性的原因可能与其促进乙烯的释放有关。,分子标记,分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特 征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。与上述三种标记相比较，分子标记具有许多明显的优越性，表现为：直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等
12、问题.数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限.多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造.表现为中性，不影响目标性状的表达.许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体.,广义的分子标记是指可遗传并可检测的特异DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记仅指DNA或(RNA)标记，而这个界定现在被广泛采纳。目前，分子标记技术（这里指DNA或cDNA分子水平上的多态性检测技术）已有:,RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisms)、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、AFLP(Amplified fra
13、gment length polymorphisms)、SSR(Simple sequence repeats)、GISH(Genomic in situ hybridization)、mRNA DD(mRNA Differential Display)、SSH(Suppression Subtraction Hybridization)、AP-PCR(Arbitray-primer PCR)、DAF(DNA amplified fingprinting)、SPARs(Single primer amplification reactions)、SCARs(Sequenced characte
14、ried amplified regions)、AMO(Anchored Microsatellite Oligonucleotides)、STS(Sequenc-tagged Site)、SNP(Single Nucleotide Polymorphism).,分子标记的种类与历史,蛋白质：同工酶(等位酶)上世纪六十年代以来核苷酸序列和片段：tRNA（1965）1980年以来：RFLP1984年以来：SSR1990年以来：RAPD1993年以来：AFLP1996年以来：DDRT-PCR,1.2 遗传物质DNA,DNA结构原理 DNA分子的结构与功能 DNA的理化性质及应用,1.2.1 DNA
15、结构原理,DNA双螺旋的发现 典型双螺旋结构,DNA双螺旋的发现,Oswald Avery(1877-1955)Microbiologist Avery led the team that showed that DNA is the unit of inheritance.One Nobel laureate has called the discovery the historical platform of modern DNA research,and his work inspired Watson and Crick to seek DNAs structure.,1943年Ave
16、ry证明DNA携带遗传信息,Erwin Chargaff(1905-2002)Chargaff discovered the pairing rules of DNA letters,noticing that A matches to T and C to G.He later criticized molecular biology,the discipline he helped invent,as the practice of biochemistry without a licence,and once described Francis Crick as looking like
17、 a faded racing tout.,1949年Chargaff发现A与T及C与G 配对现象,Rosalind Franklin(1920-58)Franklin,trained as a chemist,was expert in deducing the structure of molecules by firing X-rays through them.Her images of DNA-disclosed without her knowledge-put Watson and Crick on the track towards the right structure.Sh
18、e went on to do pioneering work on the structures of viruses.Maurice Wilkins(1916-)Like Crick,New Zealand-born Wilkins trained as a physicist,and was involved with the Manhattan project to build the nuclear bomb.Wilkins worked on X-ray crystallography of DNA with Franklin at Kings College London,alt
19、hough their relationship was strained.He helped to verify Watson and Cricks model,and shared the 1962 Nobel with them.,1952年底得到DNA的X-射线衍射图像,Linus Pauling(1901-94)The titan of twentieth-century chemistry.Pauling led the way in working out the structure of big biological molecules,and Watson and Crick
20、 saw him as their main competitor.In early 1953,working without the benefit of X-ray pictures,he published a paper suggesting that DNA was a triple helix.,1953年初提出了DNA的三螺旋模型,James Watson(1928-)Watson went to university in Chicago aged 15,and teamed up with Crick in Cambridge in late 1951.After solvi
21、ng the double helix,he went on to work on viruses and RNA,another genetic information carrier.He also helped launch the human genome project,and is president of Cold Spring Harbor Laboratory in New York.Francis Crick(1916-)Crick trained and worked as a physicist,but switched to biology after the Sec
22、ond World War.After co-discovering the structure of DNA,he went on to crack the genetic code that translates DNA into protein.He now studies consciousness at Californias Salk Institute.,1953年提出了DNA的双螺旋模型,腺嘌呤A,鸟嘌呤G,胸腺嘧啶T,胞嘧啶C,尿嘧啶U,-D-核糖,-D-2-脱氧核糖,1.2.2 DNA分子的结构与功能,DNA的超螺旋结构 原核生物：大部分原核生物的DNA是共价封闭的环状双螺
23、旋，这种双螺旋还可以再次螺旋化形成超螺旋。真核生物：DNA和蛋白质组装成染色体，染色体的基本单位是核小体。核小体由DNA和组蛋白构成。组蛋白有H1，H2A，H2B，H3和H4。H2A，H2B，H3和H4各两分子构成核小体的核心，称为组蛋白八聚体。DNA双螺旋分子缠绕在八聚体上构成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠状结构。核小体进一步旋转折叠形成棒状染色体，将近1 m长的DNA分子容纳于直径只有数微米的细胞核中。,DNA的功能,DNA的基本功能作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板，它是遗传繁殖的物质基础。基因组（genome）：一个生物
24、体的全部基因序列。最简单的生物如SV40病毒的基因组仅含有5100碱基对（base pair bp），大肠杆菌基因组的大小为5700千碱基对（kbp），人的基因组则由大约3.0109个bp组成。,1.2.3 DNA的理化性质及应用,核酸的一般理化性质:多元酸，较强的酸性;DNA为线性高分子，粘度极大，而 RNA分子远小于DNA，粘度也小得多;由于碱基成分的紫外吸收特征，DNA和RNA溶液均具有260nm紫外吸收峰。,DNA的变性,DNA变性：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链。监测指标为A260的变化。常用的变性方法为加热。增色效应（hy
25、perchromic effect）：DNA解链过程中，其A260增加，并与解链程度有一定的关系 解链曲线：在连续加热过程中以温度对A260的关系作图。解链温度：DNA变性从开始到完全解链是在一个相当窄的范围内完成 的。这一范围内A260达到最大值的50%时的温度称为解链温度，又称为融解温度（melting temperature，Tm）。Tm的大小与其所含碱基中的G+C比例相关，G+C比例越高，Tm值越高。,DNA的复性,复性:变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，称为复性。热变性DNA经缓慢冷却后即可复性，也称为退火（annealing）。DNA复性速度受温度的影响
26、，复性时温度缓慢下降才可使其重新配对复性；如加热后将其迅速冷却至4 以下，则不可能发生复性。比Tm低25为DNA复性的最佳条件。,DNA分子杂交(hybridization),双链DNA,单链DNA,杂交,在DNA复性过程中，双链分子的再形成可以发生在序列完全互补的核酸分子之间，也可以发生在碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间，这种现象称为分子杂交。,（polymerase chain reaction）,1.3 聚合酶链式反应,关于PCR，您能告诉我们,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技
27、术。,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。,PCR技术简史,PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，上世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA
28、的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。缺点：不耐热 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶。缺点：不耐热 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。优点：耐热 此酶的发现使PCR广泛的被应用。,PCR的改进与完善:,Old Faithful
29、 Geyser-Yellowstone National Park,An alien and inhospitable place,characterized by extreme heat,spewing steam into the frigid air such is the scene of old faithful geyser in Yellowstone National park.This seemingly prohibitive habitat is home to Thermus aquaticus,the bacterium from which the heat st
30、able DNA polymerase essential to PCR is obtained.,耐热性,Kary Mullis accepting the Nobel Prize,Brilliant,gifted,genius,rebel Dr Kary Mullis has been thus described,and more.Mullis discovered the PCR procedure,for which he was awarded the Nobel prize in 1993.The procedure he devised has revolutionized m
31、olecular biology,forensics,and DNA based identification technology.,PCR仪,1.3.1 PCR原理,模板,PCR原理,变性,5,3,5,3,复性,PCR原理,引物,引物,5,3,5,3,延伸,PCR原理,变性,PCR原理,复性,PCR原理,延伸,PCR原理,变性,PCR原理,复性,PCR原理,延伸,PCR原理,DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增(2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。,预变性(92-95C,2-5m),变性(92-95C,30s),复性(40-60C,30s),延伸(72C,30-
32、60s),总延伸(72C,7m),(25-35),PCR的一般过程,经过30次循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上。,PCR产物的积累规律DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n）增加，随着目的DNA的积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和平台期。（25个循环）,PCR反应的自动化,PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+Taq DNA聚合酶 来源：水生栖热菌 Thermus aquaticus 特性：良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校正功能？,1.3.2 PCR引物设计,引物长度：15-30bp，常用为20bp
33、左右。引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长 10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两引物间互补，特别是3端互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异扩增条带.引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
34、,1.3.3 模板的制备,DNA 从细胞中提取DNA：动、植物细胞、绒毛、尿样、毛发、口腔上皮细胞等 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化RNA新鲜组织或细胞所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理,1.3.4 PCR的基本反应,以DNA为模板的反应：10缓冲液 10 l4种dNTP混合物 各20 mol引物 各10100 pmol模板DNA 0.12 gTaq DNA聚合酶 2.5 uMg2+1.5 mmol加双蒸水至 100 l,以mRNA为模板的反应mRNA 5 l(约500ng)5 Buffer 4 ldNTPs 2 l(10mmol/L)RNasin 1 l(20U)AMV R
35、Tase 1 l(10U)Oligo(dT)1218(或下游引物)1 lddH2O 6l Total 20 l,42水浴1小时，95 水浴10分钟灭活逆转录酶。向上述反应体系中添加如下试剂：,10 Buffer 5 l25mmol/L Mg2+3lTaq酶 0.5 l（2.5U）上游引物 1lddH2O 20.5l Total 50 l,按PCR循环参数进行RT-PCR,1.3.5 PCR反应条件的控制,（一）PCR反应的缓冲溶液提供合适的酸碱度和某些离子1050mmol/L Tris-HCl缓冲液50mmol/L KClBSA或明胶（二）镁离子浓度 Taq酶活性需要Mg2+，Mg2+浓度过高
36、导致非特异扩增。一般常用1.5 mmol/L,（三）底物浓度 dNTP浓度在20200 mol/L 四种dNTP必须浓度相等（四）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在7080具有最高聚合活性,（五）引物引物浓度一般为0.1 0.5mol/L（六）反应温度和循环次数 预变性温度和时间 95/5min 变性温度和时间 95/30 60s 退火温度和时间 4555/30 60s 延伸温度和时间 72/30 60s 循环次数 2530,1.3.6 PCR中应注意的事项,PCR反应中可能出现的问题：假阴性，不出现扩增条带假阳性出现非特异扩增带,（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿
37、及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分,注意的事项：,1.3.7 PCR反应的特点,简便、快速：PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。,对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用植物组织、细胞，临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,特异性强：,灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=10-6)水平
38、。,1.3.8 PCR的应用,PCR技术自从1988年正式推出后，迅速风靡于世，被广泛用于DNA酶促扩增、RNA酶促扩增、直接DNA序列测定，甚至对细胞内稀有DNA进行定量测定。但PCR技术也存在一些缺点：扩增DNA的长度一般不超过2kb，TaqDNA聚合酶在合成作用时也会发生错误，出错率0.25，费用比较昂贵。目前人们正在设法克服这些缺点，而发挥PCR技术的长处。,在分子生物学基础研究上，被广泛地用基因克隆和制造突变。在临床医学上，被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒、病菌感染。用传统的方法，要检测病毒病菌的感染需要把病原体培养数周才能鉴定，而现在用，即可以迅速判断人体细胞（比如血液细胞）中是否
39、存在病毒、病菌的（比如的）而确诊。在法医上，目前已成为发现罪证的重要方法。比如，微升的唾液痕迹所含的就可以通过扩增而获得足够量的进行测序鉴定罪犯。毛发、血迹、唾沫、精液因此都可以成为重要的罪证。利用技术，科学家们已从林肯的头发和血液、埃及的木乃伊、琥珀中八千万年前的昆虫、恐龙的骨头等不寻常的样品中提取了足够的进行研究。博物馆中的化石标本都有可能成为遗传学的研究对象，一门分子古生物学因此诞生。,DNA鉴定简介,DNA分析应用于法医学鉴定是近十年来的事，目前发现的DNA多态位点越来越多，分析技术越来越精巧、简便、快速、经济，实用。世界上有120多个国家和地区已应用DNA分析技术办案，解决刑事（如杀
40、人）、民事（亲子鉴定）纠纷问题，以及追查尸体身源，包括战争及大型灾难中落难者的个人识别等，个人同一认定接近100%。DNA分析的法医学应用使以往只能检测基因编码的酶或蛋白质水平飞跃到直接检查基因的分子水平，是法学物证检验史上的一场重大的革新。,DNA鉴定过程,1.4 分子标记常用技术概述,限制性扩增片段长度多态性（RFLP）随机扩增多态性DNA（RAPD）扩增片段长度多态性（AFLP）简单重复序列（SSR）染色体原位杂交（GISH或FISH）mRNA差异显示法（mRNA DD）,1.4.1 限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphis
41、m,RFLP),8kb,5kb,3kb,在个体和群体中，片段长度表现出多态性。如3kb,5kb,7kb,8kbRFLP呈现孟德尔式遗传。常用检查方法：核酸杂交；PCR-酶切等。,probe,产生多态性的原因是内切酶位点的变化:原位点的消失；新位点的产生。,GAATTCCTTAAG,GATTTCCTAAAG,2kb,3kb,5kb,7kb,1.4.2 随机扩增多态性DNA（RAPD）,RAPD是以基因组DNA为模板，以一个随机的寡核苷酸序列作引物通过PCR扩增反应，产生不连续DNA产物，用以检测DNA序列的多态性。该方法的优点主要是:简单易行、需要的DNA量极少（15-25ng）、无放射性、实验
42、设备简单、周期短，因此受到研究者的普遍欢迎。目前该方法已广泛用于种质资源鉴定与分类、目标基因的标记等研究上，也有人利用RAPD标记来绘制遗传连锁图。,该方法的缺陷：一，多数位点的标记带表现为显性的特点，因此不能提供完整的遗传信息；二，该方法在一些作物上扩增产物的稳定性较差。在使用这一方法时，应注意：一，尽可能地把RAPD标记转化为更有效的经典PCR标记；二，严格控制模板DNA和Mg2+浓度，严格保证反应条件、反应参数的一致性。,1.4.3 扩增片段长度多态性（AFLP）,AFLP标记是RFLP与RAPD相结合的产物。其原理是选择性地扩增基因组DNA限制性酶切片段。由于不同材料的DNA的酶切片段
43、存在差异，因而便产生了扩增产物的多态性。它的多态性很强，利用一套特定的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中检测到100-150个扩增产物。,AFLP扩增可获得在某一品种出现而在另一品种不出现的特定的DNA谱带。因此，通过限制性酶切和PCR扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记。AFLP非常适合绘制品种的指纹图谱及进行分类研究。该项技术的特点是稳定性、重复性强。该技术的缺点是技术难度大，同时成本也较高。,1.4.4 简单重复序列（SSR）,真核生物基因组中散布有大量的小卫星和微卫星点。正因为真核生物中富含简单重复序列，而重复序列的两端往往是相对保守的限制性内切酶位点。所以通
44、过特异性引物进行PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳（或聚丙烯酰胺凝胶电泳）和放射自显影（或银染），这样可以检测到在简单重复序列重复单位数不同的DNA区域的多态性。SSR标记已被广泛应用于资源鉴定、连锁图绘制及目标性状基因的标记等研究上。,SSR有两大优点：一，多态性频率高，与RFLP标记相比SSR检测的多态性频率要高得多；二，具有PCR方法所具有的优点，因为SSR除用作探针外，还可以通过PCR扩增植物基因组中所含的重复序列区域。但是要克隆足够数量的SSR，并对基因进行测序和设计引物，没有足够的投资、人力和时间，是不可能实现的。,1.4.5 原位杂交（GISH或FISH）,荧光原位杂交(Fluore
45、scence in situ Hybridization,FISH):利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针，并通过荧光素偶联的抗原-抗体检测系统，在组织、细胞及染色体上对DNA或RNA进行定性或定位分析。,标记物：脱氧尿嘧啶三磷酸Bio-11-dUTP(生物素)Dig-11-dUTP(地高辛)标记方法：缺口平移法，随机引物法。,这是项利用标记的DNA探针与染色体上的DNA杂交，在染色体上直接进行检测的分子标记技术。,染色体FISH探针,整条染色体涂染探针染色体重复序列探针染色体专一位点探针,基本过程：1、染色体标本制备2、探针制备3、杂交4、显微观察,整条染色体涂染,通过整条染色体涂染判断易位染色体,染色体重复序列探针,染色体专一位点探针,荧光标记探针检测精子,Who is Who?,谢谢！,
