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1、第七章 微生物的测定,含在饮料的检测中,一、分类,碳酸饮料(品)(汽水)类 果汁(浆)及果汁饮料(品)类 蔬菜汁及蔬菜汁饮料(品)类 含乳饮料(品)类 植物蛋白饮料(品)类 瓶装饮用水类 茶饮料(品)类 固体饮料(品)类 特殊用途饮料(品)类,总酸度、pH值、还原糖含量食品中微生物的检测 细菌总数 大肠菌群数食品添加剂的检测甜味剂糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜。防腐剂苯甲酸、山梨酸,二、微生物检验,1、细菌总数菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。它可以反应食品的新鲜度、被细菌污染的程度、生产过程中食品是否变质和食品生产的一般卫生状况等。因
2、此它是判断食品卫生质量的重要依据之一。,流程,检样做成几个适当倍数的稀释液选择2-3个适宜稀释度各以1mL之量分别入灭菌平皿内每皿内加入46适量营养琼脂菌落数报告,（1）样品的无菌处理,以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎以后，放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000r/min100000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。,（2）稀释、接种,用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理
3、盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。,琼脂培养基配方,蛋白胨 10 g 牛肉膏 3 g 氯化钠 5g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml,根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。稀释液移入平皿后，应及时将凉至46营养琼脂培养基可放置在（461）0C）水浴锅内保温注入平皿15ml，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。等琼脂凝固后，翻转
4、平板，置（361）0C恒温箱内培养（482）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。,菌落计数方法,做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。平板菌落数的选择 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。,稀释度的选择,应选择平均菌落数在30
5、300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若有两上稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字。若所有稀释度平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。,简便方法：菌落总数测定纸,使用方法,2、大肠菌群的测定,大肠菌群是指在37、24h能发酵乳糖，产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰式阴性无芽孢杆菌。大肠菌群数以每100ml（g）检样中大肠菌群
6、最可能数（MPN）表示。,流程,乳糖胆盐发酵管变黄浑浊，,培养基配方,乳糖胆盐发酵双料:(1)蛋白胨 40g(2)牛胆盐 10g(3)乳糖 20g(4)蒸馏水 1000ml(5)溴甲酚紫（1.6g/t）2ml(6)PH值7.2-7.4,乳糖发酵管(1)蛋白胨 20g(2)乳糖 10g(3)蒸馏水 1000ml(4)溴甲酚紫（1.6g/t）1ml(5)PH值7.2-7.4,伊红美蓝培养基：,成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂 17g2伊红水溶液 20ml0.65美蓝水溶液 13ml蒸馏水 1000mlpH为7.1制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于热蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，1
7、21高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。,伊红美兰琼脂平板划线培养大肠菌群的典型菌落,（1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落（2）紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落（3）淡紫红色、中心色较深的菌落。,革兰氏染色阴性菌,纸片法,MPN表,阴性管数 MpN 95可信限100 mL(g)1mL(g)，*30.1mL(g)*30.0lmL(g)*3 下限上限 0 0 0 30 5 0 0 1 30 0 0 2 30 90 0 0 3 30 0 1 0 30 5 0 1 1 60 130 0 1 2 90 0 1 3 120 续表 阳性管数
8、 MPN 95可信限100mL(g)1mL(g)3 0.l mL(g)x3 0.0lmL(g)X3 下限上限 0 2 0 60 0 2 1 90 0 2 2 120 0 2 3 160 0 3 0 90 0 3 1 130 0 3 2 160 0 3 3 190 1 0 0 40 5 200 1 0 1 70 10 210 1 0 2 110 1 0 3 150 1 1 0 70 10 230 1 1 1 110 30 360 1 1 2 150 1 1 3 190 1 2 0 110 30 360 1 2 1 150 1 2 2 200 1 2 3 240 1 3 0 160 1 3 1 2
9、00 1 3 2 240 1 3 3 290 2 0 0 90 10 360 2 0 1 140 30 370 2 0 2 200 2 0 3 260 2 1 0 150 30 440 2 1 1 200 70 890 2 1 2 270 2 1 3 34o,革兰氏染色,革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。2）草酸铵结晶紫染1分钟。3）自来水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染1分钟。5）水洗，用吸水纸吸去水分。6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。7）蕃红梁色液（稀）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。染色的结果，革兰氏正反
10、应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。,分光光度计使用方法,2使用方法（1）预热仪器 将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。（2）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。（3）固定灵敏度档 使用时，调到“1”挡。（4）调节T=0%轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。（5）调节T=100%将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示正好为“100
11、.0”。（6）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。（8）关机 实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。3注意事项（1）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。（2）取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面。（3）比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭，以免损伤它的光学表面。,
