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1、1,色谱分析-研究生,2,第一章 色谱分析法概论,第一节 色谱法概述,一、什么是色谱法 色谱分析法简称色谱法(chromatography)，是一种物理或物理化学分离分析方法。,3,图示,固定相CaCO3颗粒流动相石油醚,4,第二节 色谱法的分类与历史,一、色谱法的历史1.新型固定相和检测器的研制2.色谱新方法的研究3.色谱联用技术4.色谱专家系统,5,二、分类：,1按两相分子的聚集状态分：流动相 固定相 类型,6,续前,2按操作方式分：,7,3按分离机制分：,8,图示,色谱法简单分类,9,第二章 色谱基本理论,定性参数定量参数柱效参数分离参数相平衡参数,第一节 色谱参数,10,续前,（一）色
2、谱流出曲线和色谱峰1色谱流出曲线是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。2基线是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。,一、色谱流出曲线和有关概念,11,12,3色谱峰是流出曲线上的突起部分。正常色谱峰为对称形正态分布曲线。不正常色谱峰有两种：拖尾峰和前延峰。色谱峰的对称与否可用对称因子fs(symmetry factor)，或叫拖尾因子(tailing factor)，来衡量。,13,对称因子在0.951.05之间的色谱峰为对称峰；小于0.95者为前延峰。大于1.05者为拖尾峰。,14,15,二、定性参数,（一）保留值1保留时间(retention time；tR)
3、是从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔，即从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔。2死时间(dead time；t0)是分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。,16,17,3调整保留时间(adjusted retention time；),4保留体积(retention volume；VR)是从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。,18,5死体积(dead volume；V0),19,6调整保留体积(adjusted retention volume；)与流动相流速无关 7相对保留值(relative retention；r),
4、20,8保留指数(retention index；I)又称Kovats指数，定义式如下：,Ix-待测组分的保留指数z与z+n-正构烷烃对的碳原子数n可为1、2，通常为1。,21,规定正己烷、正庚烷、正辛烷的保留指数分别为600、700、800，依次类推。同系物中，每增加1个CH2，保留指数增加100。例如 在阿皮松柱上，测定某样品的保留指数，测得数据如下：,22,tR t0样品 乙酸正丁酯 340s 30s物质对 正庚烷(Z)204s 正辛烷(Z+n)403.4s,说明乙酸正丁酯的保留行为，相当于7.756个碳的正构烷烃的保留行为。,23,三、柱效参数,（一）色谱峰区域宽度1标准差(stand
5、ard deviation；)是正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半。越大，组分越分散；反之越集中。,24,25,2半峰宽(peak width at half height；W1/2)是峰高一半处的峰宽。W1/2=2.355 3峰宽(peak width；W)是通过色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。W=4 或 W=1.699W1/2,26,（二）理论塔板数和理论塔板高度,1.理论塔板数,27,28,2.理论塔板高度,29,四、分离参数,若R=1，4分离，两峰基本分开。若R=1.5，6分离，两峰完全分开(基 线分离)。,30,2.基本分离方程式,（1）柱色谱,31,a项取决于柱效，n，a
6、项b、c项相关在GC中：b项主要受色谱柱性质影响 c项主要受柱温影响在HPLC中：b项主要取决于流动相的种类 c项主要取决于流动相的配比,32,（2）薄层色谱：,讨论：a项为薄层板板效项。N，斑点越集中，R。b项为选择项。选择合适的流动相，提高。c项为容量项。Rf2，R。最佳分离条件：Rf值在0.30.5。调整展开剂极性，使Rf值落入最佳范围。,33,（二）有效峰数（effective peak number,ENP),ENP的含义：在含有Z与Z+1个碳的正构同系物的色谱峰间能容纳的色谱峰数。ENP越大，色谱柱的分离性能越好。,34,例如：在一个20m0.24mm内径的WCOT柱，固定液为Ca
7、rbowax 20M，柱温80，测定正构醇同系物得：正戊醇、正己醇和正庚醇的保留时间分别为：554.0，870.6和1459.2s，色谱峰宽分别为：7.54，12.03和20.40s。用正戊醇、正己醇的数据计算ENP,35,（三）分离值,1.分离值在柱色谱中的定义和含义,36,例1 若RZ+1/Z=6，R*1.5，则SV=3.说明在含有Z与Z+1个碳的同系物的色谱峰间能容纳3个色谱峰。例2 若RZ+1/Z=6，R*1.0，则SV=5.说明在含有Z与Z+1个碳的同系物的色谱峰间能容纳5个色谱峰。,37,38,2.在薄层色谱法中的定义和含义,R-Rf=0和Rf1两组分斑点的分离度R*-相邻两组分斑
8、点的分离度SV的含义：在Rf=0和Rf1两组分斑点间能容纳分离度R*的相邻组分的斑点数。,39,例1 若Rf=0及Rf1两组分斑点分离度R=6，两相邻组分斑点的R*=1.5,则：,说明在薄层板上Rf=0及Rf1两组分斑点间能容纳R*=1.5的斑点3个。,40,例2 若Rf=0及Rf1两组分斑点分离度R=6，两相邻组分斑点的R*=1.0,则：,说明在薄层板上Rf=0及Rf1两组分斑点间能容纳R*=1.0的斑点5个。,41,SV的数值取决于R和R*，无统一规定，所以不便于比较，所以，常用分离数（SN或TZ）衡量色谱柱和薄层的分离性能。,42,（四）分离数（separation number,SN;
9、Trennzahl,TZ),在柱色谱法中的定义和含义,43,44,将分离度公式代入上式：,45,分离数的含义：,当相邻峰的分离度（R*)为1.177时，在含有Z与Z+1个碳同系物间能容纳的色谱峰数。用例1中的正戊醇与正己醇的数据计算SN得：,46,计算结果表明，该WCOT柱在正戊醇与正己醇间可容纳相邻峰分离度为1.177得色谱峰26.5个。,47,2.在薄层色谱法中的定义和含义,48,在薄层色谱法中，计算Rf=0及Rf=1两组分斑点的分离度时，可用下式：,49,SN的含义：,在相邻斑点的分离度为1.177时，在Rf=1及Rf=0两组分斑点间能容纳的斑点数。,50,计算结果表明，在Rf=1及Rf
10、=0的组分的斑点间，可容纳相邻斑点的分离度（R*)为1.5得斑点9.5个。,例 用硅胶板，在一定的分离条件下，得 以下数据：L=127mm，Rf=0物质的b0=3.9mm，Rf=1物质的b1=8.2mm，计算SN=?,51,五、相平衡参数,(一)分配系数1.分配系数与线性色谱(distribution coefficient；K)组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(C)之比。,52,分配系数与组分浓度大小无关，其色谱峰呈正态分布-线性色谱。非线性色谱体系的K不是常数，K随浓度而变化。分配系数由组分和固定相的热力学性质决定，随柱温而变化，与两相体积无关。在液相色谱法中，还决定于流动相的性质
11、。,53,2.分配系数与柱温的关系,Go-相对于标准状态的组分自由能R-气体常数Tc-柱温一般，温度上升20，K值约下降一半。,54,3容量因子(capacity factor；k)组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。,容量因子又称为质量分配系数或分配比。,55,Vm-色谱柱中流动相的体积，近似等于死体积V0Vs-柱中固定相的体积,56,(二)分配系数和容量因子与保留时间的关系 设流动相的线速度为u，组分的速度为v，将二者之比称为保留比：,4分配系数和容量因子的关系,57,在定距展开如柱色谱中，v=L/tR，u=L/t0，因此,58,59,60,（三）分配系数与保留体积的关系,61,（四）
12、分配系数与比移值的关系,62,（五）容量因子与比移值的关系,63,例1 组分A在柱内的移动速度只有流动相速度的1/10，柱内液体流动相体积为2.0ml，固定相体积为0.5ml。求流动相流量为10ml/min时，组分A停留在固定相中的时间和它的分配系数。,64,R=1/1+k=0.1 k=9VR=Vm(1+k)=2.0（1+9）=20mltR=VR/F0=20/10=2.0mint0=tR/1+k=2.0/1+9=0.2min,65,组分停留在固定相中的时间为：,66,例2 组分A和B分别在15.0min和25.0min洗脱出柱，而非滞留组分只需2.0min。求：1）B对A的相对保留时间 2）A
13、的容量因子 3）A滞留在流动相中的时间 分数,67,A滞留在流动相中的时间分数，即为保留比,68,六、色谱分离的前提,69,两式相减得：,70,第二节 塔板理论,塔板理论假定：在色谱柱内一小段长度H内，组分可以在两相中瞬间达到分配平衡。H称为理论塔板高度。流动相进入色谱柱不是连续的，而是间歇式的，每次进入一个塔板体积。,71,试样和新鲜流动相都加在第0号塔板上，且试样的纵向扩散可以忽略。分配系数在各塔板上是常数。,72,一、二项式分布,假设：分离含有2个组分的混合物K=Cs/Cm=2Vs=Vm试样溶液100%加到零号塔板上上层（流动相溶质含量）：mm下层（固定相溶质含量）：ms mm+ms=1
14、,73,经过N次转移后，在各塔板内组分的质量分布符合二项式的展开式：（mm+ms)N=1N=3，K=2时，mm=0.333，ms=0.667，各塔板内溶质的含量为：（0.667+0.333)3=0.297+0.444+0.222+0.037（0号）（1号）（2号）（3号）,74,75,转移N次后第r号塔板中的质量Nmr,例如，N=3，r=3时，即转移3次后，在第3号塔板内的溶质分数为：,76,二项式展开式各项相当于各塔板中某一个组分溶质的总量,组分在流动相中的含量应为：,77,78,组分在固定相中的含量应为：,79,当 n=3,r=0时,求流动相和固定相中溶质的含量,80,二、正态分布,-标准
15、差 tR-保留时间C0为峰面积A，即相当于某组分的总量 C-任意时间t时的浓度,色谱流出曲线方程式:,81,(1)t=tR时，有极大值,Cmax即流出曲线的峰高，也可用h表示。将h及W1/2=2.355代入上式，得峰面积C0或A：A=1.065W1/2h,讨论,82,将式(2)代入式(1)得：,不论 t tR或 t tR时，浓度C恒小于Cmax。C随时间t向峰两侧对称下降。,83,三、理论塔板高度和理论塔板数,84,H=L/n 如果用 代替tR，为有效塔板数：,理论塔板高度为：,85,例1 在柱长2m、5%阿皮松柱、柱温100、记录纸速为2.0cm/min的实验条件下，测定苯的保留时间为1.5
16、0min，半峰宽为0.10cm。求理论塔板高度和每米的理论塔板数。,86,每米理论塔板数为：2.4103/2=1.2103(m1),解,87,第三节 速率理论,一、气相色谱速率理论方程式 Van Deemter 方程式：H=A+B/u+Cu H-塔板高度 A-涡流扩散系数 B-纵向扩散系数 C-传质阻抗系数 u-流动相的线速度(cm/s),88,89,塔板高度由A、B/u和Cu三项构成。在低线速（0u最佳之间）时，u越小，B/u项越大，Cu项越小。此时，Cu项可以忽略，B/u项起主导作用，u增加，H降低，柱效高。在高线速时（uu最佳），u越大，Cu项越大，B/u项越小，Cu项起主导作用。u增加
17、，H增加，柱效降低。,90,（一）影响板高因素的讨论,1涡流扩散(eddy diffusion)也称为多径扩散。A=2dp-填充不规则因子 dp-填料(固定相)颗粒的平均直径,91,92,2纵向扩散(longitudinal diffusion),B=2 Dm-弯曲因子Dm-组分在流动相中的扩散系数 Dm与温度成正比，与相对分子质量的平方根成反比；纵向扩散与流动相的线速率成反比，所以使,93,用较高流速、降低柱温和采用相对分子质量较大的载气，都能减小分子扩散。载气线速度小时，用N2载气线速度大时，用H2,94,3传质阻抗(mass transfer resistance),C=Cm+Cs,95
18、,Cs-固定相传质阻抗系数k-容量因子df-固定液的液膜厚度Ds-溶质在固定相中的扩散系 数,96,减少Cs的方法：（1）降低固定液液膜厚度（2）增大Ds：柱温升高，Ds增大（3）k值对Ds 的影响：,97,当k1时，k增大，Cs减小当k 时，Cs0当k=1时，最大，柱效最低。此时，,98,（二）Van Deemeter方程式在GC中的表现形式,1.填充柱（1）一般情况下，Cm可以忽略，CCs H=A+B/u+Csu 将A、B、Cs代入上式中，则：,99,（2）快速气相色谱法,H=A+B/u+Cmu+Csu若以单位柱长计算气相传质阻抗造成的峰展宽，则：,100,将Cm及Cs代入式（1）中得：,
19、2.开口毛细管柱,101,102,二、液相色谱法速率理论,（一）Giddings液相色谱速率方程式Giddings与Snyder等人提出的液相色谱速率方程式：H=He+Hd+Hm+Hsm+Hs或：H=A+B/u+Cmu+Csmu+Csu,103,104,105,106,讨论：,1.流动相流速与板高的关系 H=A+Cu uH2.涡流扩散项 A=2dp采用小粒度、球形固定相。常用310m的填料。匀浆法装柱。,107,3.传质阻抗系数,在液相中，采用化学键合相，“固定液”只是在载体表面的一层单分子层，因此，在液相中的传质阻抗可以忽略。则：H=A+Cmu+Csmu,108,4.传质阻抗对板高的影响,109,Cm及Csm都与固定相的粒径平方dp2成正比，与扩散系数Dm成方比。因此，采用小粒度固定相及低粘度流动相。高柱温可以增大Dm，但是，有机溶剂为流动相时，容易产生气泡，因此，一般采用室温。,110,（二）柱外效应,色谱峰展宽的总方差，等于柱内、柱外及其他独立因素的方差和：,111,2.柱外峰展宽（柱外效应，外）,112,
