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1、实验五 线粒体的分离与观察,一、实验目的1.对分离得到的线粒体进行活性鉴定。2.掌握用差速离心技术分离制备线粒体的方法。,二、实验原理,细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。,分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行
2、分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。,(1)匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25molL蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。,(2)分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须
3、经反复悬浮和离心加以纯化.,(3)分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。,中性红-詹纳斯绿染色,詹纳斯绿（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色素氧化酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝绿色），在胞质区詹纳斯绿则被还原为无色。中性红的阳离子可与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。,离心技术概述,离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离技术。离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到一个向外的
4、力。与角速度和旋转半径有关。相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相当于重力加速度的倍数，表示“数字g”。,离心力g1.1110-5n2r r为离心机中轴到离心管远端的距离 n为离心机每分钟的转速（r/min）1000g=9.8牛（N）,离心技术类型,离心技术可用于细胞器的分离。离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离心,（一）差速离心（differential centrifugation）,在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。,差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的转速将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来，
5、从而使各种亚细胞组分得以分离。但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，需经反复悬浮和离心加以纯化。,（二）密度梯度离心（density gradient centrifugation）,A等速度沉降，B等密度沉降用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。,密度梯度离心法是用密度具有梯度的介质来替换离心管中的密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度的低的在上层，浓度高的在底层。将细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大小、形
6、态、密度的颗粒就会以不同的速度向下移动，集中到不同的区域，可以分别收集。细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶的活性，避免细胞器的聚集。,三、实验材料、用品1.器材：剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微镜，冷冻高速离心机等。2.材料：玉米黄化苗,四、玉米线粒体及细胞核的分离 从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能研究外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因线粒体DNA等目的。分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差数离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子
7、，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。,1.试剂1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的 Tris-HCl缓冲液（pH7.4），3 mmol/L EDTA，0.75 mg/ml BSA（牛血清蛋白）。2）保存液：0.3 mol/L 甘露醇（pH7.4）。3）20%NaClO（次氯酸钠）溶液。4）1%詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。2.器材剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微镜，冷冻高速离心机等。,实验方法1）剪取12cm长的玉米黄化苗15g，剪碎；加3倍体积的预冷的分离介质，冰浴上研磨成匀
8、浆。2）匀浆用双层纱布过滤.3）滤液700Xg离心10分钟，除去核和杂质沉淀。4）上清夜10 000Xg离心10分钟。5）沉淀为线粒体,可以存于0.3mol/L甘露醇中。6）涂片，立即滴加1%詹纳斯绿B染液，染色20分钟，盖上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。PS:以上匀浆化及离心均控制在04进行。,涂片过程：,五、实验结果光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。,五、实验报告,实验目的实验用品实验原理实验方法思考题,六、思考题,1.线粒体提取分离过程中，为什么要在04进行？2.绘制玉米黄化苗的线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,分析所分离的线粒体的纯度如何?,线粒体干物质的主要成分是蛋白质。蛋白质在室温和高温环境下都难以长期保存。低温环境能有效保持蛋白质的稳定性，包括结构和功能。温度过高，线粒体里的蛋白可能变性而丧失活性等。温度过低，虽然能有效保存蛋白质，但是低温导致膜结构脆性增大，提取过程中的物理机械剪切力可能使线粒体破损。完整得提取线粒体要注意对线粒体的各个结构的保护。,
