《RNA转录》课件.ppt

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1、第三章 RNA转录(RNA transcription),6.1.基本概念6.2.原核生物RNA转录的起始6.3.真核生物RNA转录的起始6.4.转录的延伸6.5.转录的终止6.6.原核生物转录产物的后加工 6.7.真核生物转录产物的后加工6.8.真核生物转录产物中内元的去除 6.9.不连续转录和反式拼接,第一节 基本概念,转录(transcription):是指以DNA为模板，在依赖于DNA的 RNA聚和酶催化下，以4中rNTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA 的过程。,在有些病毒中，RNA也可以指导合成RNA。,若 干 基 本 概 念 是基因表达的第一步，也是最关键的一

2、步。以Double Strand DNA中的一条单链作为转录模板(杂交实验所证实),有义链(sense strand)又称编码链 coding strand:指不作模板的DNA单链,反义链(antisense strand)又称模板链 template srand:指作为模板进行RNA转录的链,(60年代以前的表示方法与此相反)没有 AU GC 的规律,在依赖DNA的RNA聚合酶作用下进行转录 AU、CG 合成RNA分子 转录合成RNA链的方向为53，模板单链DNA的极性 方向为35，而非模板单链的极性方向与RNA链相 同，均为53。（书写）基因转录方式为不对称转录(一条单链DNA 为模板,R

3、NA 聚合酶的结合),RNA 的转录包括 promotion.elongation.terminaton 三过程 从启动子(promoter)到终止子(terminator)称为转录单 位(transcription unit)(转录起始点)原核生物的转录单位多为 polycistron in operon,真 核生物中的 转录单位多为monocistron,No operon 转录起点即转录原点记为1，其上游记为负值，下游 记为正值,第二节 原核生物RNA转录的起始(RNA Transcription promotion in prokaryots),两个相关概念:操纵元(operon):是

4、原核生物基因 表达调控的一个 完整单元，其中 包括结构基因、调节基因、操作 子和启动子,启动子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶识别 并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节 蛋白因子的结合位点(频率、效率),一、原核生物的RNA polymerase(E.coli),1、全酶(Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme),(1)全酶（Holo Enzyme）用于转录的起始 依靠空间结构与DNA模板结合(与核心酶结合后 引起的构象变化)专一性地与DNA序列(启动子)结合 结合常数：1014mol 半衰期：数小时（107mol 1秒以下）转录效率低，速度缓

5、慢（的结合）,（2）核心酶（Core Enzyme）作用于转录的延伸过程（终止）依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性 基团与DNA的磷酸根之 间）非专一性的结合（与DNA的序列无关）结合常数：1011mol 半衰期：60秒,此外，新发现的一种亚基的功能尚不清楚。2、各亚基的特点和功能（1）因子 因子可重复使用 修饰RNApol构型 使Holo Enzyme 识别启动子的Sextama Box(35区),并通过与模板链结合,2,2,2,2,（3）全酶的组装过程,不同的因子识别不同的启动子 E.coli 中有四种因子（70、32、54、28）枯草杆菌中有11种因子（因子的更替对转录起始的调控

6、）（2）因子,核心酶的组建因子,促使RNApol 与DNA模板链结合,前端因子使模板DNA双链解链为单链 尾端因子使解链的单链DNA重新聚合为双链,（3）因子,完成NMP之间的磷酸酯键的连接 Editing 功能（排斥与模板链不互补的碱基）与Rho（）因子竞争RNA 3end,E site（elongation site RifR）:对NTP非专一性地结 合（催化作用和Editing功能）,（4）因子 参与RNA非模板链（sense strand）的结合（充当SSB）,构成Holoenzyme 后，因子含有两个位点 I site（initiation site.Rifs）:该位点专一性地结合

7、ATP或者GTP（需要高浓度的ATP或GTP）,由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点,有义DNA链结合位点（亚基提供）DNA/RNA杂交链结合位点（亚基提供）双链DNA解链位点（前端 亚基提供）单链DNA重旋位点（后端亚基提供）因子作用位点,E.coli RNA polymerase,用于起始和延伸,只用于起始,36.5 KD,36.5 KD,151 KD,155 KD,11 KD,70 KD,二、启动子（promoter）的结构与功能（）1、启动子由两个部分组成（1）上游部分 CAP-cAMP结合位点（基因表达调控的正控制位点）CAP（catabolite gene Activato

8、r Protein）降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白（2）下游部分 RNApol的进入（结合）位点 35 10 包括识别位点和结合位点（R B位点）,2、RNA聚合酶的进入位点（1）Sextama 框（Sextama Box）-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点，RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点 识别位点（R位点）大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上决定了启动子的强度（RNApol 的因子）位置在不同启动子中略有变动,（2）Pribonow 框（Pribonow Box）-10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点 结合位点（

9、B 位点）一致序列：T80A95T45A60A50T96（TATPUAT）,位置范围 4 到13,因此又称TATA Box,（3）起始位点（initiation site）：1位点 RNA聚合酶的转录起始位点 起始NTP多为ATP或GTP,起始过程：a.全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成（R位点被因子发现并结合）,b、开放型启动子复合物的形成 RNApol的一个适合位点到达10序列区域，诱导富 含AT的Pribnow 框的“熔解”，形成1217bp的泡状 物，同时酶分子向10序列转移并与之牢固结合 开放型启动子复合物使RNApol聚合酶定向 两种复合物均为二元复合物（全酶和DNA）,1

10、217bp,c.在开放型的启动子复合物中，RNApol的I位点和E位点的 核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（亚基）三元复合物形成+1位多为CAT模式,位于离开保守T 69 个核苷酸处,（4）因子解离 核心酶与DNA的亲和力下降 起始过程结束核心酶移动进入延伸过程,转录的起始过程,核心酶,1217bp,3、CAP-cAMP 结合位点（也称CAP位点）转录调控中，I 阻遏蛋白 负调控 lac 操纵子模型,I,许多基因的表达还存在正调控机制 例如:E.coli 培养基中乳糖和葡萄糖共存时 只有葡萄糖被 利用 原因：CAP位点的正调控 葡萄糖缺少时，腺苷酸环化酶将ATP cAMP，cAMP与CAP位点

11、结合,此时启动子的进入位点才能 与RNApol结合 葡萄糖存在时，cAMP不能形成，没有CAPcAMP 与CAP位点结合，启动子的RNApol进入位点不能结 合RNApol,因此,一个操纵元中有两道控制开关,只有同时打开,结构基因才 能进行转录。（对 lac操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）（1）CAP位点的组成（70 40）位点：70 50 包括一个IR 序列 强结合位点 位点：50 40 弱结合位点 位点对位点具有协同效应（cooperativity）,（2）位点结合CAPcAMP复合物后，促使RNApol进入 Sextama Box,最终与10序列结合起始转录 原因：CAP

12、cAMP复合物与位点结合 Sextama Box 富含GC区域（GC岛区）稳定性降低 Pribnow Box 的溶解温度降低 促进开放型启 动子复合物的形成 促进转录,上节课内容回顾:1、原核生物RNApol：2、原核启动子的结构：RNApol进入位点 起始过程 上游位点的组成和功能,4、RNApol 在DNA上结合位点的鉴定 DNase 法-40bp 而足迹法（footprinting）结果相对准确 足迹法原理：限制酶切割结合有RNApol的DNA 大分子DNA 末端标记该DNA（Klenow片段标记3,碱性磷酸酯 酶标记5）用内切酶降解DNA（控制反应条件）凝胶电泳分离，放射自显影观察,大

13、片段DNA,末端标记大分子DNA,重新结合RNApol,作对照直接用DNase 进行降解,电泳,用微量DNase降解,电泳,用足迹法鉴定出来的 RNApol 与DNA的结合区域为+20 50（40），大约 60 70 bp 实验中还发现.,5、启动子各位点与转录效率的关系（1）35 序列与10 序列与转录效率的关系 标准启动子 35 TTGACA 10 TATAAT,则不同的启动子 a.与标准启动子序列同源性越高 启动强度越大,b.与标准启动子同源性越低 启动强度越小 c.与标准启动子差异很大时 由另一种因子启动,原因:,35序列通过被 因子识别的容易 决定启动子强度 10序列影响开放型启动子

14、复合物形成的速度 决定启动子强度,（2）35序列与10序列的间隔区与转录效率的关系 碱基序列并不重要 间距非常重要，17bp的间距转录效率最高 间距上的突变种类：间距趋向于17bp 上升突变 间距远离17bp 下降突变,启动子上升突变、启动子下降突变,E.Coli各识别的启动子的序列,第三节 真核生物RNA转录的启动RNA Transcription promotion in Eukaryots,一、真核生物的RNApol 1、三种RNApol：根据对-鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApol 最不敏感（动、植、昆）RNApol 最敏感 RNApol 不同种类的敏感性不同 2、位置和转录产物

15、RNApol 核仁 活性所占比例最大 转录rRNA（5.8S、18S、28S）,RNApol 核质 主要负责 hnRNA、snRNA 的转录 hnRNA（mRNA 前体，核不均一RNA heterogeneous nuclear RNA）snRNA（核内小分子 RNA small nulear RNA)RNApol 核质 负责 tRNA、5S rRNA、Alu序列和 部分 snRNA 目前在线粒体和叶绿体内发现少数 RNApol（活性较低）,3、亚基组成：分子量500KDa,含两个大亚基和 712 个小亚基 RNApol：大亚基中有 C 末端结构域(carboxy terminal domai

16、n CTD)CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复 TyrSerProThrSerProSer C 端重复七肽 不同生物中重复数目不一样（酶活性）,CTD中的 Ser和 Thr可被高度磷酸化 磷酸化的 RNApol 被称为A 非磷酸化的 RNApol 称为B CTD参与转录 B A 使 RNApol易于离开 启动子进入延伸过程（10倍）二、真核生物的启动子 三种 RNApol 三种转录方式 三种启动子 三类基因，类 类 类,1、RNApol的启动子 结构最复杂 位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成 通用型启动子（无组织特异性）（1）帽子位点（cap site）：转录起始位点 与Prok.的

17、“CAT模式”相似（2）TATA框（Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框）位于30处 一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）,定位转录起始点的功能（类似原核的Pribnow框）TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的（3）CAAT框（CAAT box）位于75bp处,一致序列为GGC/TCAATCT 前两个 G 的作用十分重要(转录效率)增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性（距转录起始点的距离，正反方向）以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在,（4）增强子（enhancer）（又称远上游序列 far upstream seq

18、uence）在100以上 SV40的两个正向重复研究得最清楚（DR）-107178、179 250 各 72bp 该增强子的特点如下：对依赖于TATA框的转录的增强效应高于不依赖 的情况,距离效应:离72bp越近的容易起始转录 转录方向离开72bp的起始序列优先转录 细胞类型的选择：不同类型中作用有差异 表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白）（5）GC框（GC box）位于90附近，较常见的成分 核心序列为GGGCGG 可有多个拷贝，也可以正反两方向排列,（6）其他元件 八聚核苷酸元件（octamer element OCT元件）一致序列为 ATTTGCAT KB元件 一致序列为 GGGA

19、CTTTCC ATF元件 一致序列为 GTGACGT 还有一些位于起始点下游的相关元件（7）不同元件的组合情况 不同元件的数目、位置、和排列方向均有差异 例如：SV40的早期启动子中有6个GC框,小结：不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同 不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交 启动子功能没有变化 各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定 了转录的起始,2、RNApol 启动子结构（1）分为三类，每种识别方式不同 a、下游启动子（内部启动子）位于转录起始点的下游 5SRNA 和 tRNA基因 可分为两类 b、上游启动子 snRNA,（2）内部启

20、动子的发现 最早发现于非洲爪蟾的5S rRNA基因 试验设置：非洲爪蟾的卵母细胞提取液作为体外转录体系，进行缺失试验 以不同长度的5S rRNA基因为模板进行转录 结果：缺失55以前和缺失80以后的序列都能正常转录 缺失55到80序列不能转录,结论：5S rRNA基因的启动子位于基因内部 该启动子可使RNApol在其上游的55bp处起始转录（3）内部启动子分为两类 均含两个短序列元件，中间由其他序列隔开 第一类：含A框和C框（5S rRNA基因）第二类：含A框和B框（tRNA基因、VARNA基因）间隔序列长短差异很大 其中内部启动子起被 RNApol 识别的作用,上节课内容回顾:,1、RNAp

21、ol在DNA上结合位点的鉴定,2、启动子的各部位与转录效率的关系,3、真核生物RNApol：种类及各自转录的基因 亚基组成,4、RNApol的启动子,5、RNApol的启动子,三、真核生物转录的起始,三种RNApol均没有对启动子特异序列的识别能力,转录起始过程需要很多的辅助因子(转录因子)参与,并且按一定顺序与DNA形成复合物,协助RNApol定 位于转录起始点,RNApol,RNApol,RNApol 的转录起始 两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子 TFA 一种含锌指结构的蛋白 TFB 由TBP和BRT、B”TFC 至少5个亚基以上,TBP 的作用 所有 RNApol 的转录起始都需

22、要TBP 在 RNApol的转录起始过程中,TBP是SL1的 组份，起定位RNApol的作用 RNApol的转录起始由TBP识别TATA框 TBP 起定位作用,所以又称定位因子（positioning factor）,第四节 转录延伸 Transcription Elongation,一、起始到延伸的转变 始于第一个磷酸二酯键的形成 伴随着DNA分子和酶分子构象的变化 1、Prok.起始时，因子有利于 和 亚基具有与DNA专一 性结合所要求的构象 起始后,因子解离,和 亚基构象发生变化 2、Euk.多种辅助因子的共同作用来保证这一转变,二、延伸过程（Prok）酶与产物RNA不解离 底物NTP不

23、断加到RNA链的 3-OH 端 形成一个磷酸二酯键后，核心酶向前滑动 延伸位点不断地接受新的NTP，RNA链不断延伸 始终保持三元复合物的结构,1、转录泡 RNApol 结合和转录的DNA模板区域，有17bp左右 DNA形成解链区 转录泡处杂交双链很短 胰脏 RNAase_其长度10bp（不准确）推测也就两个核苷酸左右,2、拓扑学问题 RNA合成过程中，转录泡两端要发生拓扑转变 RNApol 的前沿.解螺旋作用 RNApol 后端.DNA的螺旋化（保持）超缠问题的解决靠DNA旋转酶 RNA-DNA杂交链也要求作旋转运动,3、转录过程中的延宕（1）RNA的合成速度大约 30 50 个核苷酸秒,与

24、蛋白 质的合成速度相近（15个AAsec）（2）模板DNA中GC 的存在,延宕,（GC后的 810 个核苷酸）延宕作用在RNA链的终止和释放中起重要作用思考:延宕发生的原因?,第五节 转录的终止 Transcription termination,终止过程：酶停止添加底物释放RNA链酶解离 终止反应杂合双链的氢键断裂，重新形成双螺旋，酶的解离。终止子（terminator）：在转录的过程中，提供转录终止 信号的RNA序列 真正起终止作用的是RNA序列与启动子不同 Prok.和Euk.都具有一种基因表达调控的手段,一、原核生物的终止子 1、终止子的种类（1）内在终止子（不依赖 因子的终止子）体外

25、实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止（2）依赖因子的终止子 蛋白质辅助因子因子存在时，核心酶终止转录 两者有共同的结构特征（序列差异）,2、不依赖 因子的终止子 结构特征:一是形成一个发夹结构 茎.720 bp的IR序列形成（富含G/C）环.中间不重复序列形成 发夹结构的突变可阻止转录的终止 二是6 8 个连续的U串（发夹结构末端）,不依赖终止子结构,茎部富含GC,3、依赖 因子的终止子（1）结构 IR序列中的 GC 对含量较少 发夹结构末端没有固定特征（2）靠与的共同作用而实现终止,无连续 U串,G/C含量较少,二、原核生物转录的终止 1、不依赖因子的终止子终止转录（1）新生RNA链发

26、夹结构形成,与RNApol发生作用,造成高度延宕（典型的有60秒左右）,（2）RNApol暂停为终止提供了机会，6 8个连续的U 串可能为RNApol与模板的解离提供了信号 RNADNA之间的 rUdA 结合力较弱,阻止RNA链的释放,于是：RNADNA解离 三元复合体解体 RNApol解离 转录终止（3）真正的终止点不固定，在 U串中的任何一处（4）IR序列和U串同等重要 IR中的GC对含量的减少 U串的缩短或缺失（5）DNA上与U串对应的为富含AT的区域 说明：AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用,2、依赖 因子的终止子终止转录（1）通读（read through）：在依赖 因子的

27、转录终止 过程中，RNApol 转录了 IR 序列之后，虽发生 一定时间的延宕，但如果没有 因子存在，则 RNApol 会继续转录（2）因子 a、活性形式为六聚体 促进转录终止的活性，NTPase 活性,b、RNA长度大于50nt时，依赖RNA的NTPase活性最大 说明：因子识别和结合的是RNA（3）因子对终止子的作用 a、因子与RNA结合（终止子上游的某一处，RNA的5端）,b、因子沿RNA从53移动（NTP水解供能）（终止子处的较长时间的延宕给因子追赶的机会）,c、因子与 RNApol 相互作用而造成转录的终止,结合上来追赶RNApol,追赶上来（暂停）,与RNApol相互作用使杂交链解

28、链,（4）终止反应还需要 RNA 与 DNA 的相互作用 即：需要一定的RNA序列 因为：其与模板的结合力必须弱到一定数值，才能配合 因子与 RNApol 的作用（发夹结构下游的AU序列）序列不同的终止子不同的终止程度基因表达 调控的途径之一,（5）Prok.依赖因子的终止子为基因表达调控 提供了一种方式 因为：Prok.中转录与翻译偶联？为什么同一个转录元里近基因的一个无义 突变能阻止远基因的表达这一极性现象,三、终止与抗终止及抗终止因子,各种生物采用不同的手段控制不同发育阶段 的基因表达,*枯草杆菌-更替因子*T7噬菌体-更换RNApol*噬菌体采用依赖于因子的终止以及通过抗 终止因子的抗

29、终止作用,Phage的操纵元组织情况,PM,PL,PR,PR,重组,复制,裂解,溶原周期,溶菌周期,PN,PQ,抗终止作用的过程,早期,迟早期,晚期,抗终止的机制,依赖于噬菌体本身的依赖因子的终止子依赖因子的终止子上游有抗终止信号(靠近PL 的nutL，靠近tR1的nutR nutPN utilization)抗终止蛋白和nut位点的结合，等待RNApol经过 时修饰RNApol的构象，拮抗寄主编码的终止蛋白的活性,使之通过那些依赖的终止子,上节课内容回顾:,1、转录的延伸,2、转录的终止,不依赖因子的终止子终止转录 依赖因子的终止子终止转录,3、抗终止,四、真核生物的终止子及转录终止,了解很

30、少（3 末端）,1、RNApol的终止子类似Prok.不依赖因子终止子，终止可能靠RNApol本身完成 SV40的终止子:发夹结构 U串,2、RNApol的终止子类似原核生物（发夹结构 U串）U串位于发夹结构的顶端 且保守性很强（酵母人）环和柄对转录的终止同等重要,第六节 原核生物转录产物的后加工Pre-RNA processing in Prokaryotes,Prok.的mRNA半衰期只有几分钟（基因表达调控的一种手段）,rRNA、tRNA比较稳定 半衰期几小时,成熟分子和转录产物的差别：,5单磷酸三磷酸,分子大小,异常碱基,一、rRNA 后加工,1、基因排列方式,三种 rRNA 基因（5

31、S、16S、23S）与tRNA 的基因形成操纵元（rrn）（E.coli 七个）,每个rrn中 tRNA 基因无固定模式（种类、数量、位置）,三个rRNA基因的相对位置有一定规律 16S rDNA间隔 tDNA.23S rDNA.5S rDNA收尾 tDNA,加工过程主要是RNAse等酶的作用,二、tRNA的转录后加工,1、tRNA 基因,（1）转录单元大多是多基因的 同一个tRNA基因、不同tRNA基因、与rRNA基因,（2）有两种类型的 tRNA 基因：型 具有3端的CCA序列 型 没有3端的CCA序列,（3）型需在酶的作用下切除CCA下游一段序列（Prok.的tRNA多为型）,型需要在酶

32、的作用下添加CCA序列（少数 Phage、Euk.）,2、参与 tRNA后加工的酶（1）RNAaseP：内切核酸酶，核蛋白 使 tRNA产生成熟的 5端,识别tRNA的空间构象,（2）RNAaseD：外切核酸酶，使型 tRNA暴露出CCA端,a、RNAaseP 存在时 RNAaseD可达最大活性,b、RNAaseQ、RNAaseY、RNAaseP3与此酶功能相同,（3）tRNA核苷酸转移酶（tRNA nucleotidyl transferase）以ATP和CTP为前体，催化 tRNA（型）的3端生成CCA,a、E.coli中该酶基因突变后，会影响菌株生长（CCA末端常丢失）,b、识别tRNA

33、的空间结构，无种属特异性,（4）RNAase：与RNAaseO、RNAaseP2的功能相似，负责切 开间隔序列,3、E.coli 的 tRNATyr1分子的修饰过程 编码基因的原始转录物,间隔子,（各长350base）,有一个tRNATyr1的转录单元的原始转录物的修饰过程,三、RNA中的甲基化及常见的修饰核苷酸,m5C,m6A,CH3,H3C,Prok.中主要是碱基的修饰 Euk.核糖、碱基,常见tRNA中的修饰核苷酸,第七节 Euk转录产物的后加工 Pre-RNA processing in Eukaryotes,一、rRNA的转录后加工 主体rRNA基因（5.8S、18S、28SrDNA

34、）组成一个转录单元,47S前体,45S前体,a、甲基化位点可能是酶识别的标志,b、加工的对象是一种核蛋白,c、哺乳动物的45SRNA前体有几种不同的加工方式,二者的共同之处:,先切除18S rRNA之前5端序列,18S rRNA部分与后面的5.8S rRNA和28S rRNA 部分分开,5.8S rRNA和 28S rRNA通过碱基配对相结合,Euk.的 5S rRNA,二、mRNA的转录后修饰-帽子 1、帽子的种类 帽子0（Cap-0）m7GpppXpYp-（共有）m7G N7甲基鸟苷 帽子1（Cap-1）m7GpppXmpYp-第一个核苷酸的 2-O 位上产生甲基 化（A N6 位甲基化）

35、帽子2（Cap-2）m7GpppXmpYmp 第二个核苷酸的 2-O 位上产生甲基 化（A、G、C、U）,HNCH3,m7G,帽子0,其中:,单细胞真核生物只有 Cap0,Cap1 是其余真核生物的主要帽子形式,Cap2 存在于某些真核生物中,2、帽子结构的生成,甲基供体都为S腺苷甲硫氨酸（SAM）,RNA鸟苷酸转移酶-戴帽酶（capping enzyme）,3、帽子结构的功能,（1）对翻译起识别作用-为核糖体识别RNA提供信号 Cap0 的全部都是识别的重要信号 Cap1,2 的甲基化能增进识别,（2）增加mRNA 的稳定性，使5端免遭外切核酸酶的攻击,（3）与某些RNA病毒的正链合成有关（

36、Cap1、Cap2）,除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化m6A形式,三、mRNA的转录后修饰二-多聚（A）尾巴,1、3端-约长200bp(大多数Euk.的mRNA)（poly(A)+poly(A)-）,最近研究发现，原核生物的RNA转录后也有3添加 poly(A)的现象,E.coli 的poly(A)+聚合酶早在1962年就已发现,2、poly(A)的生成,a、RNA末端腺苷酸转移酶（poly(A)聚合酶）催化 前体ATP,反应如下：多聚核糖核酸+nATP,Mg+或 Mn+,多聚核糖核酸(A)n+nPPi b、添加位点 内切酶(360KDa)切除一段序列,由poly(A)聚合酶 催化添加

37、poly(A),内切酶的识别位点（有其它因子参与）,切点上游 1320bp处的 AAUAAA 切点下游的 GUGUGUG（单细胞Euk.除外）,上节课内容回顾:,1、Prok.转录产物的后加工 rRNA tRNA,2、Euk.转录产物的后加工,尾巴的生成,主体rRNA,帽子结构,3、poly(A)的功能,c、对含 poly(A)的mRNA 失去 poly(A)可减弱其翻译,（1）可能与核质转运有关）,（2）与mRNA的寿命有关,（3）与翻译有关,a、缺失可抑制体外翻译的起始,b、胚胎发育中，poly(A)对其mRNA的翻译有影 响（非poly(A)化的为储藏形式）,（4）poly(A)在分子生

38、物学实验中有很大应用价值,a、也可将 oligo(dT)与载体相连，从总体RNA中分离 纯化mRNA,b、用寡聚dT（oligo(dT)）为引物，反转录合成 cDNA,第八节 Euk.转录产物中内元的去除Intron removing in Eukaryote,一、概述,1、概念,割裂基因（split gene）：指编码某一RNA的基因中有些 序列并不出现在成熟的RNA序列中，成熟RNA 的序列在基因中被其他的序列隔开,内元（intron）：原初转录物中通过RNA拼接反应而被去 除的RNA序列或基因中与这些RNA序列相应的 DNA序列,外元（excon）：,RNA拼接（RNA splicing

39、）：一个基因的外元和内元共同 转录在一条转录产物中，将内元去除而把外元连 接起来形成成熟RNA分子的过程,拼接点：5 拼接点或左拼接点（内元上游）3 拼接点或右拼接点（下游）,2、内元的分类,1982 Davies等人,中部核心结构（central core structure）:在有些内元 中，含有4个重复的保守序列，长度为 10 20bp，4个保守序列构成一种二级 结构，在拼接中起重要作用,由于并非所有的内元都有中部核心结构，所以有了内元的分类,类内元（group）:含有中部核心结构的 细胞器基因 核基因,类内元（group）:不含有中部核心结构 细胞器线粒体基因内 核基因,类内元（gro

40、up）:具有 GUAG 特征的边界序列 核基因mRNA前体,tRNA基因的内元 均位于 tRNA 的反密码环上,四种内元的边界序列各有一定共同的特征,3、拼接方式,方式一：由拼接装置完成（核mRNA内元）可供识别的特异序列 拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成,方式二：自我拼接（两类内元、）形成特定的二级结构 RNA具有催化拼接的能力,方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA）前两种拼接都属于转酯反应,二、tRNA的拼接（酵母为例）,1、链的断裂和连接是两个独立的过程,2、tRNA的内元均位于反密码环的3端，与反密码子相距 一个Nt（40400）,长1416bp，其中含一段与反密码环互补的序列

41、 反密码环处形成一个与成熟tRNA不同的构象,3、拼接酶系识别的是二级结构,酵母tRNAphe,4、拼接过程 研究方法 构建温度敏感突变体（高温时.）,分离累积tRNA前体,体外加入野生型细胞抽提液,研究拼接过程,第一步：内切酶作用,释放一条线状内元分子和两个“tRNA半分子”,两个tRNA半分子采取成熟tRNA分子的构象(切刻),第二步：RNA连接酶连接断端,其中 内切酶作用后产生 5OH 和 3磷酸，3磷酸端很快转 变为2，3环式核苷酸,因此，一个半分子有两个磷酸末端，一 个半分子有两个 OH末端,连接反应前要进行两个反应：,a、左外元的3端成为OH（环式磷酸二酯酶）其 3 位为OH，2

42、位为磷酸,b、第二个外元的 5端转变为 磷酸基（多聚核苷酸激酶）,因此 连接后还要切除第一个外元的 2磷酸 这是 tRNA内元拼接重要特点之一,前体RNA,两个半分子,进行两个连接反应,成熟tRNA,三、第 类内元的拼接 特点：拼接属于自我拼接 形成明显的二级结构 1、结构特点：（1）5 拼接点和3 拼接点-U G,5 exonUintronGexon3,（2）有由保守序列形成的二级结构 a、保守序列为 5 PQRS3 距拼接点很远，各 1012bp P与Q互补、R与S互补而形成中部核心结构,b、二级结构中还包括内元与外元的某一序列互补所形成 的二级结构,内部引导序列（interal guid

43、e sequence IGS）：内 元中能与两个拼接点边界序列配对的一 段序列,#第一类内元的拼接依赖于以上二级结构 为自我拼接的进行提供活性位点,2、拼接机制（以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例）（1）两种rRNA转录在一条35S的产物中，26SrRNA 有内元,5 U G 3 小rRNA 大rRNA（26S 有内元）,（2）35SRNA体外有自我拼接的能力 反应需要：一价和二价离子 鸟苷酸辅助因子（GTP GDP GMP和 鸟嘌呤核苷）不需能量的供给,（3）拼接反应后，G与内元（414base）5端以磷酸二酯 键相连（放射性标记试验）,（4）具体的拼接过程 第一步：游离G发动的转酯反应 G

44、 的 3-OH 攻击内元的 5拼接点,G-内元、左外元（有游离3OH）,第二步：游离外元（左）发动的转酯反应 左外元的3-OH 攻击3拼接点，同时释放 线状的内元,形成成熟RNA分子,两次转酯反应是紧密偶联的 释放出的内元可继续进行转酯反应 而形成环状,（5）自我拼接过程主要由转酯反应构成，且完全由内元自身 完成-自我拼接的最大特点,转酯反应是.,内元自身能形成特定的二级结构，产生适于拼接反 应的构象和活性位点,在G的参与下完成拼接反应(内部引导序列),这一机制如下图所示:,科罗拉多大学Cech等人完成（美）,活性位点,上节课内容回顾:,1、pol(A)的生物学功能,2、Euk.转录产物内元的

45、去除,tRNA内元的拼接,内元的分类,拼接方式的种类,第类内元的拼接：结构特点、拼接机制,3、内元的催化功能,35SRNA前体拼接释放的内元（414base）进行的自身转 酯反应,（1）线状分子自身环化能力及环化后的逆环化,逆环化,逆环化,（2）C15:逆环化 将UUU加到 5端的能力 表明:该环形产物具有连接两个RNA分子的能力,（3）L19：具有酶活性 即Cech等人证明的 L19 的 polyC 聚合酶活性,L19 分子,L19 分子,（4）总结：a、四膜虫的 35SRNA 的内元有自身催化的性质 即-将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷 酸二酯键，不需要额外的能量,因此：内元可以看

46、作是 RNA重排酶（RNA rearrangease）或 RNA异构酶（RNA isomerase）,其中：拼接反应中，“酶”和底物是同一个分子，且反应后 变成了不同的分子,b、L19的 polyC 聚合酶活性进一步表明 L19 具有酶的 主要特征：,专一性强,加快反应速度,反应前后酶分子保持不变,人们称这种由RNA构成的酶为-,核糖核酸酯酶（ribozyme）可简称 R酶,四、第二类内元的拼接,1、拼接点序列,7核苷酸的保守序列（Branch Site）3 拼接点上游 6bp 12bp 处,在Branch Site 的两侧存在一些短的序列，与其上游10-50Nt处互成 IR,形成茎环结构(但

47、A 不包含在 IR序列内,从而被排除成芽状突起）,5-GUGCG-PyPuPyPyUAPy-PyAU3,2、拼接机制（Splicing mechanism）,转酯攻击位点,五、核基因mRNA内元的拼接,1、相关概念 Euk.的细胞中，有许多碱基数在100 300之间 的小分子RNA,每个细胞有 105106个,snRNA：细胞核中的（snRNP）scRNA：细胞质中的（scRNP）,2、核mRNA内元拼接的结构特点,内元拼接与其他加工同时进行,拼接点序列,Breathnach-Chambon rule（GUAG规则）,3、拼接机制（Splicing mehanism),SnRNA(or ScR

48、NA)与拼接点序列间存在互补区域 并参与剪接,形成拼接体(spliceosome)。,Spliceosome 逐级组装，SnRNA（U1、U2、U5和 U4U6）分步替代,U1通过与 5拼接点互补而结合,U2识别并结合分支 点A,U1和U2作用使内元的 5端和 3端带到 一起（U1与 3拼接点配对）,U1、U2、mRNA与 U4U5U6复合物形成一个完整的拼接体,第一次转酯左外元、内元剪切套索,lariat,第二次转酯exons连接、套索状内元释放,拼接体（spliceosome）解体与lariat降解同步,第九节 不连续转录和反式拼接Discontinuoustranscription an

49、d Trans-splicing,顺式拼接：通过拼接将一个RNA分子的内元拼接掉，使外元 连接在一起（cis-splicing）,反式拼接：发生在两个RNA分子之间的拼接（trans-spling）,一、不连续转录的发现 1982 Vander Ploeg等人 研究锥虫的可变表面糖蛋白基因时发现,在其mRNA的 5端有35个 bases 是其基因中所没有的 锥虫的全部mRNA都含有这个 35bases 序列,称其为前导序列（leader sequence）,1、前导序列,由位于基因组其它区域的连续重复序列转录而来,200 copies左右,每个重复单位的 3端还有100base 的一段序列（内

50、元）,因此 一种完整 mRNA 的前导序列及特异基因编码的 mRNA序列 部分的转录是不连续的,每个重复单位的前导序列后面存在一个真核生物典型的 5拼接点 GU,而完整 mRNA 的特异基因编码的 mRNA 序列的前面都 有一个保守的 3拼接点 AG,以及分支点 A,二、反式拼接,前导序列与特异基因编码的 mRNA 序列部分形成成熟的 mRNA 的拼接方式属反式拼接,1986 W.J.Marphy 和 R.E.Sutton,1、前导序列的 3 区和mRNA的 5区各相当于一个内元 的一半,2、拼接过程形成 Y 型结构,线虫的肌动蛋白基因、植物叶绿体基因,本章内容结束,名词解释转录 启动子 RN