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1、代谢调节与代谢工程,(1).直线式代谢途径中的反馈抑制：苏氨酸脱氨酶苏氨酸-酮丁酸异亮氨酸反馈抑制其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成(2).分支代谢途径中的反馈抑制：在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物发展出多种调节方式。主要有：同功酶的调节，顺序反馈，协同反馈，积累反馈调节等。,3.2.3 反馈抑制的类型,代谢调节与代谢工程,(1)同功酶调节isoenzyme,定义：催化相同的生化反应，而酶分子结构有差别的一组酶。意义：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代谢的几个最终
2、产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。某一产物过量仅抑制相应酶活，对其他产物没影响。举例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节,代谢调节与代谢工程,代谢调节与代谢工程,(2)协同反馈抑制,定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。举例：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。,代谢调节与代谢工程,天冬氨酸 E,R 4-磷酸天冬氨酸E天冬氨酸半醛E,R E二氢吡啶二羧酸 同型丝氨酸同型丝氨酸磷酸E,
3、R R O-琥珀酰同型丝氨酸 苏氨酸 E,R六氢吡啶二羧酸 胱硫醚 2-酮丁酸 R 二氨基庚二酸同型半胱氨酸 R 赖氨酸 甲硫氨酸 异亮氨酸,天冬氨酸族（谷氨酸棒杆菌）,代谢调节与代谢工程,合作反馈抑制,定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的70%和10%。,代谢调节与代谢工程,(3)积累反馈抑制,定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制作用
4、是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。,代谢调节与代谢工程,Try 16%CTP 14%氨甲酰磷酸 13%AMP 41%,积累反馈抑制E.coli谷氨酰胺合成酶的调节,代谢调节与代谢工程,(4)顺序反馈抑制,一种终产物的积累,导致前一中间产物的积累，通过后者反馈抑制合成途径关键酶的活性，使合成终止。举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节,代谢调节与代谢工程,分支途径上游的某个酶受到另一条分支途径的终产物，甚至于本分支途径几乎不相关的代谢中间物的抑制或激活，使酶的活力受到调节，此即代谢互锁。,4.1.8 代谢互锁,代谢调节与代谢工程,在分支合成途径中，分支点后的两种酶竞争同一种底
5、物，如AMP与GMP，Thr与Lys、Met，由于两种酶对底物的Km值（即对底物的亲和力）不同，故两条支路的一条优先合成。,优先合成,代谢调节与代谢工程,避开微生物固有代谢调节，过量生产代谢产物,工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。人工控制代谢的手段：改变微生物遗传特性(遗传学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）；改变细胞膜透性；,代谢调节与代谢工程,工业发酵的目的大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。,在正常生理条件下,微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通
6、常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物,代谢的人工控制,人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行,代谢调节与代谢工程,（1）对于直线式代谢途径：选育营养缺陷性突变株只能积累中间代谢产物 A a B b C c D d E,1)营养缺陷型菌株的应用,末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物C。,遗传学方法,代谢调节与代谢工程,(2)分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中间产物,代谢调节与代谢工程
7、,各图成立的条件：1.限量添加E；2.限量添加E；3.限量添加E和G；4.限量添加E和G；5.限量添加I,“”表示营养缺陷突变位置；“”表示反馈调节解除,要根据其不同反馈控制机制,代谢调节与代谢工程,谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产 E：表示反馈抑制；R：表示反馈阻遏,高丝氨酸脱氢酶（HSDH）,天冬氨酸激酶（AK),赖氨酸生产菌:,高丝氨酸缺陷型,代谢调节与代谢工程,分支途径赖氨酸发酵(谷氨酸棒杆菌的代谢调控),代谢调节与代谢工程,分支途径肌苷酸发酵（IMP合成途径的代谢调控）,调控理论的实践应用,代谢调节与代谢工程,P124表3-12用营养缺陷型菌株生产的各种氨基酸,代谢调节与代谢工程,
8、2)抗反馈控制突变株的应用,抗反馈控制突变株是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性突变株和营养缺陷性回复突变株中获得。获得方法及其原理：,代谢调节与代谢工程,代谢调节与代谢工程,营养缺陷型回复突变株,调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：,一是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；,另一种可能仅仅是催化亚基发生突变。,一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平。,如果前者发生回复突变，则又有两种可能性,另一种是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能。,营养缺陷型回复突变,代谢
9、调节与代谢工程,3)选育组成型突变株和超产突变株,如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶 的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变株称为 组成型突变株。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。,代谢调节与代谢工程,组成型突变株,结构基因不受控制地转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏。,调节基因发生突变,产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合,操纵基因突变,突变操纵基因不能与阻遏物结合,组成型突变,代谢调节与代谢工程,DA B C
10、 E F,2.生物化学方法,1.添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生,(-),(-),(-),2.添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底物的衍生物。3.发酵与分离过程耦合：4.控制发酵的培养基成分：,代谢调节与代谢工程,控制细胞膜渗透性,使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。(1).用生理学手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺损 如:在Glu发酵中把生物素浓度控制在亚适量可大量分泌Glu；控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是M
11、n2+；Mn2+的作用与生物素相似。(2).利用膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。,代谢调节与代谢工程,控制细胞膜的通透性,生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅基，该酶催化乙酰CoA的羧化生成丙二酸单酰CoA，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸,只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌。,
12、甘油缺陷型菌株,添加适量的青霉素,油酸缺陷型菌株,代谢调节与代谢工程,谷氨酸发酵,一、谷氨酸发酵菌种：Corynebacterium pekinenseCorynebacterium glutamicumBrevibacterium flavu二、发酵机理：谷氨酸以-酮戊二酸为碳架；当以糖质为发酵原料时，合成途径包括EMP,HMP,TCA循环,乙醛酸循环等；谷氨酸产生菌的-酮戊二酸氧化酶活力很弱或缺少，而谷氨酸脱氢酶的活力要很高；生物素是谷氨酸产生菌必需的一种维生素，在谷氨酸生物合成中起着重要作用，缺乏或量太高都会使谷氨酸合成受阻。生物素通过影响细胞膜的通透性而影响谷氨酸发酵。,代谢调节与代谢
13、工程,回补顺序,谷氨酸,+NH3,谷氨酸脱氢酶,-酮戊二酸氧化酶,代谢调节与代谢工程,1.谷氨酸生产菌中存在2个糖酵解途径EMP/HMP,生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度,而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变,丙酮酸积累,乳酸积累,2.-酮戊二酸氧化酶缺失,TCA环阻断，-酮戊二酸积累,代谢调节与代谢工程,3.四碳二羧酸的来源,在生产菌中检出CO2固定反应酶活性,磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶,谷氨酸对糖的转化率达到81.7%,DCA循环,标志酶：异柠檬酸裂解酶,在谷氨酸发酵中，DCA环一方面可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充,在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量,作用,谷氨酸生成
14、期中要封闭DCA环？,通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为54.4%,代谢调节与代谢工程,4.异柠檬酸脱氢酶活力强,提供NADPH,用于还原-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系,5.氨的导入,合成谷氨酸的反应有3种：,-酮戊二酸,+,NH4+,NADPH,+,谷氨酸,H2O,NADP,+,+,谷氨酸脱氢酶,-酮戊二酸,+,天冬氨酸或丙氨酸,谷氨酸转氨酶,谷氨酸,-酮戊二酸,+,-酮戊二酸,+,谷氨酰胺,NADPH,+,2谷氨酸,NADP,+,谷氨酸合成酶,代谢调节与代谢工程,生产菌中,谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑,谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重
15、视,谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶,氨的导入时,生物素缺乏，NH4+影响糖代谢速度：提高糖代谢速度,高效合成谷氨酸,生物素充足时，NH4+不影响糖代谢速度,6.谷氨酸合成的调节机制,谷aa比天冬aa优先合成,谷aa脱氢酶,谷aa对其反馈抑制和反馈阻遏,柠檬酸合成酶,TCA的关键酶，受能荷调节，谷aa反馈阻遏，乌头酸反馈抑制,异柠檬酸脱氢酶,-酮戊二酸反馈抑制,-酮戊二酸脱氢酶先天丧失或微弱,PEP受天冬aa反馈抑制，受谷aa和天冬 aa反馈阻遏,代谢调节与代谢工程,7.细胞膜通透性控制,代谢调节与代谢工程,生物素,阻断脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,表面活性剂,对生物素有拮抗,阻断脂肪酸
16、的合成,影响细胞膜的合成,在对数生长期添加青霉素,抑制细胞壁合成,细胞膜损伤,甘油缺陷型,磷脂的合成受阻,影响细胞膜的合成,油酸缺陷型,阻断不饱和脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,代谢调节与代谢工程,三磷酸腺苷(ATP)是为许多反应提供能量的高能磷酸化物,细胞中的ATP、ADP和AMP含量处于相对平衡的状态细胞中的能量状态,能荷（Energy charge）,能荷（Energy charge）来表示细胞中的能量状态。能荷（EC）可用下式来表示：,系统中只有ATP时，EC值为1；只有AMP时，EC值等于0。,代谢调节与代谢工程,能荷不仅能调节分解代谢形成ATP的酶活性，也能调节合成代谢利用ATP的
17、酶活性。,细胞能荷可调节酶活性,高能荷抑制异柠檬酸脱氢酶和磷酸果糖激酶等,柠檬酸和ATP都是磷酸果糖激酶活性的抑制剂，从而限制了葡萄糖的利用速度。,有氧条件下，大量合成ATP，细胞能荷增加,异柠檬酸脱氢酶受到ATP抑制，导致柠檬酸的积累,代谢调节与代谢工程,在厌氧条件下，酵母菌无法通过呼吸链产生ATP，细胞能荷较低。,ADP和AMP激活磷酸果糖激酶，使利用葡萄糖生产酒精的速度加快。,代谢调节与代谢工程,第十二章 工业微生物发酵产品,调节点主要在三个激酶，即己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶。它们是糖酵解途径中的关键酶，是糖酵解途径的三个不可逆步骤,糖代谢的调节主要是能荷的控制,代谢调节与代谢工
18、程,无机聚磷酸的代谢与功能,磷酸盐和能量的储存。重金属阳离子的解毒作用。,代谢调节与代谢工程,活性污泥中的聚磷菌 生活在营养丰富的环境中，在将进入对数生长期时，为大量分裂作准备，细胞能从废水中大量摄取溶解态的正磷酸盐，在细胞内合成多聚磷酸盐。细菌经过对数生长期而进入静止期时，若环境中的磷源仍有剩余，细胞又有一定的能量时，仍能从外界吸收磷元素，这种对磷的积累作用大大超过微生物正常生长所需的磷量，可达细胞重量的6-8，有报道甚至可达10。以多聚磷酸盐的形式积累于细胞内作为贮存物质。当细菌细胞处于极为不利的生活条件时，例如使好氧细菌处于厌氧条件下，即所谓细菌“压抑”状态时，聚磷菌能吸收污水中的乙酸、
19、甲酸、丙酸及乙醇等极易生物降解的有机物质，贮存在体内作为营养源，同时将体内存贮的聚磷酸盐分解，释放到环境中来，以便获得能量，供细菌在不利环境中维持其生存所需，此时菌体内多聚磷酸盐就逐渐消失，而以可溶性单磷酸盐的形式排到体外环境中。,代谢调节与代谢工程,概念：有氧条件下，发酵作用受抑制的现象（或氧对发酵的抑制现象）。意义：合理利用能源,通风对酵母代谢的影响,巴斯德效应(The Pasteur effect),现象：,代谢调节与代谢工程,巴斯德效应（Pasteur effect）机理,巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现：厌氧条件下酵母菌进行酒精发酵，葡萄糖的消耗速度很快；而在有氧条件下，酵母菌进行呼
20、吸作用，糖的消耗速度较低，酒精产量也降低。,呼吸抑制发酵作用的的现象,巴斯德效应的本质是能荷调节。,代谢调节与代谢工程,Cratree效应,在一些代谢旺盛的正常组织和肿瘤细胞中，即使在有氧的条件下，仍然以糖无氧酵解为产生ATP的主要方式，这种现象称为Cratree效应或反巴斯德效应。,代谢调节与代谢工程,经后人研究认为：在酵母系统中主要是在高葡萄糖时抑制了细胞色素a的合成，使积累的NaDH+H+抑制丙酮酸脱氢酶系统，从而使丙酮酸进入不了三羧酸循环并诱导出丙酮酸脱羧酸而使丙酮酸形成乙醇。,代谢调节与代谢工程,在细菌系统中过高的葡萄糖和细菌比生长速率会阻遏与生长关系密切的磷酸化位点I使生长减慢和引起乙醇形成，另过高的比生长速率还会抑制存在于细胞系统中的细胞色素d而使碳流部分走糖酵解途径。克勒勃屈利效应是糖代谢中重要调节机制。,
