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1、全内反射荧光成像基本原理 Total Internal Reflection Fluorescence(TIRF),全内反射荧光显微镜(TIRFM),目前用于单分子研究的检测技术主要有两大类：扫描探针显微技术（SPM）和光学技术。其中：,SPM,原子力显微技术（AFM）,扫描离子电导显微技术（SICM）,扫描隧道显微技术（STM）,上世纪80 年代，Axelrod 等生物物理学家对 TIRFM 技术及基本原理进行描述，并探索了其在生物方面的应用。,发展历程,Axelrod,Julius,阿克塞尔罗德（Axelrod,Julius)美国生物化学家及药理学家。1970年他与卡茨冯奥伊勒共享了诺贝尔
2、生理学和医学奖。于美国卫生研究院度过其大部职业生涯。他研究药物及激素的作用、神经冲动传播的化学方面，并特别研究松果体的功能。,光反射和折射示意图,全内反射示意图,光的反射和折射,Snell定律：,当入射角不断增大，透射角为增大 90时，入射角达到临界角 c。依据 Snell 定律得出：,当入射角继续增大时，光不再透射进水溶液，即发生了全内反射。,实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会透过临界面渗透到水溶液中，平行于界面向水溶液中传播，这一部分透过的能量场则称之为“隐失波”或“隐失场”。,隐失波,隐失波,隐失波的频率与入射光线的频率相同，其强度随临界面的垂直距离呈指数衰减：,其中：Z是离开
3、分界面的距离，I(z)表示距离界面Z处的强度；I(0)表示临界面处的强度。,由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利用隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光团，而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了显微成像的对比度和信噪比。,d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的距离。,隐失波的渗透深度d12是入射角及相对折射率的函数。d12是渗透深度,它等于从分界面处到光强衰减到分界面处数值l/e的处的距离。对于可见光波长而言，浸透深度约为100 nm。,隐失波强度成指数衰减曲线,隐失波存在的实验证明,两块光密媒质做的棱镜中间夹一薄层空气层(光疏媒
4、质)。如果不断减少空气层的厚度,由于空气层中有透射波,这透射波进人第二块棱镜。,光学隧道效应,光强度并不发生全反射,而是有隐失波存于介质2中。当光疏介质薄膜的厚度小于隐失波的渗透深度时,这个波不仅穿过了光疏介质,而且会促进邻近高折射率介质3中的电子作受迫振动,由此产生了新的次波,隐失波的形态发生了显著改变,全反射被破坏,能量发生了流动,导致了光学隧道效应的产生。,全内反射荧光显微技术，是利用光发生全内反射时产生的隐失波照明样本，仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团。,与传统的荧光显微镜相比，使显微成像在Z轴上的空间分辨率得到了显著改善，大大提高了图像的信噪比和对比度。,全内反射荧光显微成像系统,
5、分子荧光的产生,当一束特定波长的光照射到物质时，物质分子与光量子发生“碰撞”。如果这次碰撞时有效的：,激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。荧光：10-7-10-9s磷光：10-4-100s,分子荧光的产生,电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态）,在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（n,）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述：M2S11 电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或1/2，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能级通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，M=1，成为单重态。,当成对电子中的一个被激发到S1、S2等电子能级激发态时，其自旋不
6、变，即仍和处于基态的另一电子成对。这些能态都被称为单线态或单重态(singlet state)。但如果处于第一电子激发态最低振动能级的电子通过无辐射跃迁（系间跨越，intersystem crossing)改变自旋方向，则因消耗部分能量而降至另一种激发态：S1/21/21，多重度 M2S12113，这种电子激发态称为三重态(triplet state)。,分子荧光的产生（雅布隆斯基分子能级图）,荧光发射：电子由第一激单重态的最低振动能级到基态，多为S1-S0。由于基态中也有振动弛豫跃迁，这使得发射荧光的能量比分子吸收的能量要小，所以，荧光的特征波长比入射波长要长。荧光是相同多重态间的允许跃迁，
7、产生速度快：10-910-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射，荧光马上会消失。磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（10-410s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。,分子荧光的产生,目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类型：棱镜型和物镜型(或无棱镜型)。,棱镜型,全内反射荧光显微镜结构,全内反射荧光显微镜结构,物镜型使用高数值孔径(NA14)的物镜作为荧光信号的接受器，同时又作为发生全内反射的光学器件，样品的放置非常方便，并且可与多种技术联用，例如纳米操纵、光镊技术、原子力显微镜等。,该系统的关键是高数值孔径物镜的使用。由于细胞的典型折射率为133138，因此要实现全内反射，物镜的NA必须大于138，表达式为：,NA=n sin n sin n sin c,其中，NA为物镜的数值孔径，n，分别为物镜的折射率(浸没油)和孔径角。c为发生全内反射时的临界角。物镜的数值孔径越高，则有更多的孔径范围可被利用，且容易校准光束。,物镜型全内反射荧光显微镜示意图,
