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1、第三节 动物的克隆,1.动物细胞全能性的特点？随着细胞分化程度的提高而全能性逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。2.离体的植物细胞和组织可以通过组织培养技术克隆成完整的植株，那么动物细胞和组织能否也进行同样的克隆？不能，动物细胞的全能性受到限制，到现在为止将离体的动物细胞直接克隆成个体还很困难，所以动物细胞和组织不能进行与植物一样的个体克隆。,动物细胞的培养和克隆形成,机械消化或者胰酶消化,一、动物细胞、组织培养,1.什么方法取得离体的单个动物细胞？,2.离体的动物细胞能否正常的生活、表现出正常的生命活动？,能，在人工控制的培养条件下，生长、分裂乃至接触抑制和衰老、死亡等，并呈现一
2、定的组织特性。,3.是不是所有的动物细胞都能在离体的情况下表现出生命活动？,(1)幼嫩细胞（如：动物胚胎或幼龄动物组织、器官）(2)含全部营养物质的液体培养基和适宜的环境条件。,（胰蛋白酶）,动物细胞培养：体外培养分散后的单个细胞，使其得以生存，并保持生命活动现象。像体内一样呈现一定的组织特性。,动物组织培养：体外培养动物组织，使其维持生活状态或生长特性。可以伴随组织分化，但最终成为细胞培养。,动物器官培养：体外培养动物器官原基、部分或整个器官，使之得以保存、生长。保持器官的结构、功能及分化能力。,组织培养,7.1951年，海拉细胞系的建成。,6.1950年，人工培养液“199”研制成功,1.
3、1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。,2.1903年，皮肤及白细胞在腹水及血清中存活一个月，且观察到细胞分裂。,3.1907年，蛙胚神经管在蛙淋巴液中悬浮培养，成功看到神经末端的阿米巴运动。,4.1912年，鸡胚浸出液对鸡胚心脏组织块进行原代培养和传代培养。,5.1943年，获得长期培养细胞系（可连续传代）和细胞克隆。,“组织培养”一词产生,真正的组织培养开始；创立了悬浮培养法,成功进行了传代培养；发明了卡氏瓶；,标志着组织培养工作进入全新阶段,二、动物组织培养技术的发展,2.适宜的环境条件无菌、无毒环境：加抗生素，定期更换培养液适宜的温度和pH值：温度：36.50.5 pH值：适宜的气
4、体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）适宜的渗透压等,（一）培养条件,三、动物细胞培养过程,成分：水、无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素和动物血清等,1.含全部营养物质的培养液,（二）培养过程,卡氏瓶,如何界定原代培养和传代培养？为什么要传代培养？,细胞悬浮液,为什么？,从动物胚胎或幼龄动物组织切片中取小片样品,转入特殊培养液原代培养,分装到多个卡氏瓶中传代培养,单个细胞悬浮液,细胞系,机械消化或胰酶消化（胰蛋白酶）,（二）培养过程,动物组织细胞间隙中含有一定量的胶原纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,原代培养物,二氧化碳培养箱 通过在培养箱内模拟形成一个类似
5、细胞或组织在生物体内的生长环境，如恒定的pH值（）、稳定的温度（37C）、较高的相对湿度（95%）、稳定的CO2水平（5%），来对细胞或组织进行体外培养的一种装置。,1.离体动物细胞的生长特性：,（1）贴壁生长：悬浮液中分散的细胞紧贴培养瓶内壁才能生长。（2）接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂。（3）正常的生命活动：生长、分裂、有规律的衰老、死亡等现象，但不分化。,2.传代培养的原因：,如果不进行传代培养，就会因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。,原代培养物,细胞系：可连续传代的细胞 原代培养物在首次传代时就成为细胞系。,能连续培养的,连续细胞系,不
6、能连续培养的,有限细胞系,四、细胞系、细胞株,（二倍体细胞）,（异倍体核型细胞）（1）恶性细胞系，异体致瘤性（2）保留接触抑制，不致癌,（遗传物质改变，不死性）,2.细胞株：,通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞系。如：单抗细胞株,细胞株一般具有恒定的染色体组型、同工酶类型、病毒敏感性和生化特性等。遗传物质未改变。,连续细胞株：可连续多次传代的细胞株。,有限细胞株：传代次数有限的细胞株,细胞系：泛指可传代的细胞。细胞株:具有特殊性质的细胞系。,五、克隆培养法（细胞克隆）,1.概念：把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。,2.
7、特点：,遗传性状均一、表现的性状相似，便于研究,异质性细胞系,克隆培养,纯系（克隆）,3.最基本要求:,保证所建成的克隆来源于单个细胞,4.适合于克隆的细胞：对环境有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞,5.提高细胞克隆形成率的措施：,选择适宜的培养基添加血清（胎牛血清）(能促进细胞的生长、增殖和贴附)以滋养细胞支持生长（经射线照射的小鼠成纤维细胞）激素刺激（胰岛素等）使用CO2培养箱，调节PH,群体细胞 单细胞无限细胞系、转化或肿瘤细胞 原代细胞、有限细胞系,6.细胞克隆的主要用途：从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。用于研究细胞的遗传规律和生理特性。,六、动物的细胞融合技术及
8、应用,1.动物细胞融合,两个或多个细胞融合成一个细胞的现象,（1）原理：,（2）诱导方法：,灭火的仙台病毒、聚乙二醇、电融合技术,（3）意义：,克服了远缘杂交不亲和的障碍,是研究细胞遗传、免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段,细胞膜的流动性,三、动物的细胞融合技术及其应用,什么是细胞融合技术？,为什么要进行细胞融合？,如何实现细胞融合？,定义 指用自然或人工方法,使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。,1.动物细胞融合,受精作用,两个细胞正在融合,诱导融合的因素生物法：灭活的仙台病毒诱导融合（特有）这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故
9、。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。化学法：聚乙二醇诱导融合（应用最广泛）物理法：电刺激诱导融合,病毒颗粒黏 附细胞表面,细胞膜连接,细胞膜被 病毒颗粒穿通,细胞融合、形成杂种细胞,5.应用,3.利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。,2.克服远缘杂交不亲和的障碍,鼠鸡、鼠兔、鼠猴、人鼠、人兔、人鸡、人蛙、酵母菌鸡、人胡萝卜等,此技术有什么缺点和优点？,1.由于细胞杂交中染色体容易丢失，因此利用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物减少的对应关系，可以进行基因定位。,读下面一段文字资料，思考以下问题：,长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分
10、离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。,1.运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？2.能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？,设计方案：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖,-化学性质单一、特异性强的抗体。,杂种细胞,单克隆抗 体,尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖
11、。,1.用外界抗原刺激动物（如小鼠，兔子等），使其产生免疫反应，使B淋巴细胞产生抗体；2.利用仙台病毒或聚乙二醇等作为介导，使经免疫的动物的脾细胞与可以无限传代的骨髓瘤细胞融合；（3）经过筛选、克隆培养，获得来自单一细胞的既能产生特异抗体、又能无限增值的杂交瘤细胞克隆,单抗的制备过程,1.体外培养：通过动物细胞培养技术获得大量的杂交瘤细胞，从细胞培养液中获得的单克隆抗体；2.体内培养：将杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中增殖，最后从小鼠的腹水中提取、纯化单克隆抗体。,思 考：,（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？,细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅
12、具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。,(2)制备过程为何要经过两次筛选？,第一次筛选获得多种杂交瘤细胞 第二次筛选出特异抗体的杂交瘤细胞。,（3）制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？,细胞融合技术、细胞培养技术。,动物的克隆繁殖,一、动物细胞全能性的表现程度,1、动物的受精卵，卵裂球含有2-8个细胞时，每个细胞具有全能性。,2、随着胚胎发育的继续，有的细胞只具有分化出各种组织细胞的潜能，这样的细胞叫多能干细胞。,3、有的细胞只能分化为一种细胞，叫单能干细胞。,受精卵,胚胎干细胞,多能干细胞,单能干细胞,体细胞,2、低等动物细胞：全能性一般容易体现。,1
13、、高等动物细胞,3、癌细胞：仍能逆转为正常细胞。,无论分化还是癌变，变化的都是表现型，基因组成的完整性可以保留。,一、动物细胞全能性的表现程度,为什么动物细胞很难表现出全能性？,二、动物难以克隆的根本原因,基因的选择性表达（差异表达），使得细胞中合成了专一的蛋白质，即动物细胞已经发生了分化。分化的细胞，其基因组中的基因不同时进行活动。,动物基因组,一类基因：维持生存，各种细胞中都处于活动状态,一类基因：随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。,动物细胞难以实现克隆，那么如何实现动物的克隆？,多莉的培育用到了哪些技术?,核移植、动物细胞培养、胚胎移植,三、核移植和动物的克隆繁殖,1、核移植：利用
14、一个细胞的细胞核（供体核）,来取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”（重组细胞），使发育成一个新的个体。,胚胎细胞克隆：使用的供体核来自胚胎,体细胞克隆：使用的供体核来自体细胞,1952年，罗伯特.布里格斯：豹蛙 囊胚细胞核+去核的卵母细胞 发育成个体,1978年，童第周：黑斑蛙成体红细胞核去核的卵细胞中发育成蝌蚪,2、动物克隆繁殖：,胚胎细胞核移植成功率远高于成体细胞核移植。,体细胞克隆羊成功的分子细胞生物学机理：,1、核移植前对乳腺细胞的营养限制性培养（调节牛血清浓度）和电脉冲细胞融合技术，有利于核的变化和细胞融合后基因表达分子开关启动。2、重组卵细胞最初分裂时，转录并未开始。3、
15、重组卵细胞的供体核DNA丢失了来源于乳腺细胞的阻止核基因表达的调节蛋白。4、开始第三次分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，核DNA被重新编排，胚细胞开始表达自己的基因。,体细胞克隆羊的培育成功，证明了什么？高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能。在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核（包括异源的细胞核）发育的作用。（核质互作）,体细胞核移植技术存在的问题：,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。,3、动物克隆成功的条件：,（1）具有包含本物种完整基因组的细胞核的活细胞 如：乳腺上皮细胞；（2）能有
16、效调控细胞核发育的细胞质物质 如：去核卵的细胞质；（3）完成胚胎发育的必要的环境条件 如：诱导重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境,4、动物克隆的意义：（1）有利于遗传疾病的治疗，优良品种的培育（2）对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩群有重要意义（3）丰富人们的物质生活，降低畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率,1、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）A、容易产生各种变异 B、具有更强的全能性 C、取材十分方便 D、分裂增殖的能力强,D,2、下列为有关动物细胞培养的叙述，其中不正确的是A用于培养的细胞
17、大都取自胚胎或幼龄动物的器官或组织B将所取的组织先用胰蛋白酶等进行处理使其分散成单个细胞C在培养瓶中要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离，制成悬浮液D动物细胞培养只能传50代左右，所培养的细胞全部衰老死亡,D,2、用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是A都需用CO2培养箱 B都须用液体培养基 C都要在无菌条件下进行 D都可体现细胞的全能性3、动物细胞克隆是指 A一个单细胞培养成一个新的细胞群的技术 B一个重组细胞经分裂、分化发育成一个动物个体的技术 C几个同种动物的细胞培养成一个新的细胞群的技术 D一个卵裂球经胚胎分割发育成四个细胞群的技术,C,A,4、某研究小组为测定药物对体外培
18、养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行动物细胞培养。下列说法正确的是()A.在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理B.细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是刺激细胞的呼吸C.甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象D.仅用该培养液也能用来培养乙肝病毒,C,5.下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是()A.培养中的人效应T细胞能产生单克隆抗体B.培养中的人B细胞能够无限地增殖C.人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株D.用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞,D,世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔细看图
19、后回答问题：,b,图中 过程为。通过过程形成的重组细胞核遗传物质与质遗传物质各来自哪里？实施时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是：。b过程细胞分裂的方式是，此过程是否进行细胞分化？（答“有”或“无”）图中c所指过程为，图中d指的是克隆绵羊“多莉”经过在母体子宫内 后。“多莉”面部的毛色和性别与 绵羊相同，请根据遗传学原理说明判断依据：。若不考虑环境因素影响，多莉的性状是否全部像以上绵羊？为什么？（7）植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物。,细胞核移植,具有调控细胞核发育的细胞质物质,有丝分裂,有,胚胎移植,妊娠,出生,白面,“多莉”绵羊的核基因和性染色体全部来自白面绵羊,细胞核
20、也具有全能性,卵细胞细胞质的遗传物质也能控制某些性状,6、若不考虑环境因素影响，克隆羊的性状全部像白面绵羊吗？原因是？右图技术具有多种用途，但是不能（）A.有选择地繁殖某一性别的家畜B.繁殖家畜中的优良个体C.用于保存物种D.改变动物的核基因 在现有技术条件下，还不能将从动物体内分离出来的成熟的体细胞直接培养成一个新个体，而是必须将体细胞的细胞核移植到去核的卵细 胞中才能发育成新个体，你认为原因最可能是（）A.卵细胞大，便于操作B.卵细胞含有的营养物质多C.卵细胞的细胞质可使体细胞核全能性得到表达D.重组细胞才具有全能性,D,C,卵细胞细胞质的遗传物质也能控制某些性状,细胞贴壁过程,细胞在贴壁生长过程中,随着细胞分裂,数量不断增加,最后形成一个单层,此时细胞间相互接触,细胞分裂和生长停止。,接触抑制,
