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1、第9讲 动物细胞培养生物制药I,先看看人体的一些细胞,免疫细胞,白血球,巨噬细胞,歼灭癌细胞,细胞与细胞,树突细胞,骨细胞,成骨细胞,胶质细胞,视网膜视杆细胞,黑色素细胞,本节主要内容,1.动物细胞培养的特点2.动物细胞培养的条件、方式3.原代培养、传代培养技术,本节关键问题,问题1：动物细胞体外生长特点问题2：动物细胞培养的培养基特点问题3：动物细胞原代培养方法问题4：动物细胞传代培养方法,（一）动物细胞培养的特点,1 定义：动物细胞培养（Animal cell culture）是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。2 历史：1907年,哈里森（Harrison）采用
2、盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。法国学者卡雷尔（Carrel）设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大推动了动物细胞培养技术的建立。1951年，厄尔利（Earle）等人开发了动物细胞体外培养的培养基。伴随着培养工具与培养基的不断完善，动物细胞体外培养技术日益成熟。,3 应用领域,生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用蛋白基础研究的细胞材料：细胞模型种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子细胞,4 特点,动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏感。动
3、物细胞生长缓慢，易受污染。正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。动物细胞间主要以聚集体形式存在，大多需要贴附在载体表面才能生长。,体外生长的动物细胞一般具有贴附、细胞接触性抑制、密度抑制的特点。悬浮型细胞：与微生物、植物细胞不同，动物细胞中只有极少数细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，称之为悬浮型细胞。血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞。贴附型细胞：大多数哺乳动物细胞必须附着在带适量正电荷的固体或半固体表面才能生长。属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：,A 成纤维细胞型细胞,外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规则形。成群细胞
4、呈现放射状、旋涡状等形式。多数细胞之间排列疏散，有较大的细胞间隙。,B 上皮型细胞,类似上皮细胞的细胞，特点是：扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现“铺路石状”，局部可以单层的上皮状“膜片组织”。皮肤的表皮细胞、消化管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等。,C 游走型细胞,呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。,D 多形型细胞,多形型细胞是一些形态上不规则的细胞。多形型细胞不常见，只有某些像神经组织细胞
5、等难以确定其稳定形态的，才可归于多形细胞。体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经原和神经胶质细胞。,接触性抑制(Contact inhibition)是某些动物细胞体外培养的生长特性之一。是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象（图11.2）。由于这个特性，正常细胞并不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。密度抑制(Density inhibition)细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂。但是当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象,（二）动物细胞培养的条件,严格的无菌技术:细菌真菌支原体病毒交叉污染1.培养基对于营养要求非常苛刻，氨基酸、维生
6、素、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子等。包括：天然、合成、无血清培养基三种。,（1）天然培养基,动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液、鸡胚胎汁等。优点：营养价值高缺点：成分复杂、来源有限、成本较高血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝或去纤维蛋白法)的血浆。,（2）合成培养基,优点：成分已知，便于对实验条件进行控制。缺点：无法替代一些未知成分解决途径合成培养基中添加小牛血清，彼此互补目前常用的合成培养基包括：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等.,例如,MEM培养基：厄尔利（Earle）于1951年开发成功。含有少量氨基酸、维生素、谷氨酰胺以及必须的无
7、机盐，组成简单。DMEM培养基：由杜尔贝科（Dulbecco）等在MEM培养基基础上研制而成，增加了各已有成分的含量，同时又根据葡萄糖高低分为高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型适合生长较快、贴附性差的细胞（例如肿瘤细胞）培养。,（3）无血清培养基,血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的成分 血清培养基缺点：（1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用。（2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过程不易检测控制。（3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养产物的分离、提纯以及检测造成一定困难。,无血清培养基,无血清培养基(Serum free medium,S
8、FM)是不含血清的动物细胞培养基，由基础培养基和添加组分组成。试图全部替代血清成分。基础培养基较常用的是DMEM、F12培养基。添加组分主要包括：细胞外基质、生长因子、结合蛋白与转运蛋白、酶抑制剂等。,2 其他溶液,（1）平衡盐溶液（Balanced salt solution，BSS）主要由无机盐组成，具有维持细胞渗透压、调控培养液酸、碱度平衡的功能。例如：Hanks液注：酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。,（2）培养基pH调整液.大部分合成培养液都呈微酸性。常用pH调整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。注：
9、HEPES是一种非离子两性缓冲液，其在pH 7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力：化学名：2-4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylethanesulfonic acid。中文名：4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸。分子式：C8H18N2O4S,（3）细胞消化液,从组织块消化分散得到单个细胞 传代培养时分散细胞胰蛋白酶溶液：水解细胞间的蛋白质，加血清终止反应乙二胺四乙酸二钠（EDTA）消化液：解离细胞,两者常结合使用，增加效果。,（4）抗生素溶液,防止微生物污染。常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等。,3 培养条件,影响动物细胞体外生长的因素包括生物因素、化学因素、
10、物理因素。生长条件的控制主要包括温度、pH、渗透压、气体等。温度：人类和哺乳类动物细胞培养适宜温度为36.55。pH：哺乳动物细胞为。渗透压：细胞在高渗透压或低渗透压溶液中会发生皱缩或肿胀，甚至破裂。BSS溶液。气体：细胞的生长代谢离不开气体，主要包括O2和CO2。二氧化碳培养箱。,4 培养工具,新型培养器皿的设计成功和一些培养技术的建立促使动物细胞培养日趋成熟。1923年卡雷尔（Carrel）（法国医学家、生物学家，1912年诺贝尔生理医学奖）设计了用于动物细胞培养的卡式培养瓶，培养鸡胚心肌组织获得成功。培养瓶的形状主要是适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。培养瓶主要有高硼硅玻璃培养瓶与
11、聚苯乙烯塑料培养瓶。卡式培养瓶可以较好地保证无菌的环境，为细胞提供生长空间，这为随后的动物细胞体外大量培养发挥了重要作用。,CO2培养箱,哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样,需要在恒定温度下才能生存,温差变化一般不应超过0.5度，因此培养箱对温度应具有较高灵敏度。CO2培养箱的优点在于能恒定地供应一定量的CO2,一般5%即可维持培养液PH值稳定。,过滤装置,各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。微化滤膜滤器是目前应用最广泛的过滤装置。,同微生物、植物细胞培养不同，动物细胞培养的培养基与其他溶液不能经受高温灭菌，多采用过滤除菌（例如支原体污染），因此需要特殊的滤器。支原体（mycopla
12、sma）：又称霉形体，是一种能够自我复制的最小的原核微生物，没有细胞壁，许多常见的抗生素（如青霉素）对支原体是无效的。四环素类、大环内酯类等作用于核蛋白体的抗生素有抑制作用。大小为0.2-0.3m，可通过一般滤菌器，40纳米过滤技术可去除。,水纯化装置细胞培养对水的质量要求较高。一般需要使用重蒸或三蒸水配制各种培养用液。,（三）动物细胞培养方式,动物细胞培养可以分为贴壁培养、固定化培养、悬浮培养三大类。1 贴壁培养（Adherent culture）是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。优点：容易更换培养液；容易采用灌注式培养、不需过滤系统；同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例、适用于所有
13、类型细胞。缺点：扩大培养比较困难、投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长。,（1）贴壁材料,要求：具有亲水性、正电荷。常用材料：硅硼酸玻璃（卡氏培养瓶等）、聚苯乙烯（96孔培养板等）对微载体而言还要求具一定三维结构。,（2）贴附生长过程,游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。吸附期：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数细胞都可在24小时内贴壁。繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片。出现接触性抑制。退化期：细胞长满培养瓶壁，随着营养物的消耗和代谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不及时传代培养，细胞会从瓶壁上脱落死亡。,细胞贴
14、壁过程,2 固定化培养,可以采用类似植物细胞固定化培养的方法对动物细胞进行固定化培养。具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。固定化方法与植物细胞类似。,3 悬浮培养,是指细胞在反应器中自由悬浮生长。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞、血液白细胞、淋巴细胞，某些肿瘤细胞等属于此类细胞。贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。,（四）动物细胞小规模培养,1 培养瓶培养法1923年，卡雷尔（Carrel）设计成功卡氏瓶，可以保证动物细胞培养的无菌环境和生长空间。培养瓶培养法是目前动物细胞小规模培养的主要
15、方法之一。,2 培养板培养法（微量培养法）,现代体外培养技术最为常用的方法之一。基本要点：将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。常用的培养板有6孔、24孔、96孔培养板。,3 灌注小室培养法,1912年由伯罗设计了一种简单的灌注小室培养模型。基本要点：将细胞接种于一个由上下两个盖玻片（分别构成上壁与下壁）与一金属圈（构成侧壁）密封围成的小室内，保持在一定条件下培养。在小室的侧面分别有液体流入和流出的开口，供新鲜培养液流入和旧培养液排出。显著特点：营养液可以循环供应,4 转管培养法,1933-1934年，盖尔（Gey）和刘易斯（Lewis）建立了旋转管培养方法，将培养物接种于一
16、管状培养器皿中，再将其固定在一可以旋转的装置上旋转培养。旋转管培养方法克服了静置培养的不足，例如：细胞生长环境不均匀、不利于营养的吸收等，培养物可以交替地接触培养液和气体环境，利于细胞或组织生长。,（五）动物细胞原代培养,接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单个细胞再进行培养，在首次传代前的培养称为原代培养（Primary culture）。一般持续1-4周。在这个阶段，细胞有分裂但不旺盛。细胞多呈二倍体核型。这样的细胞称为原代细胞（Primary cell）。优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内的形态学特征。在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，原
17、代细胞是很好的实验材料，例如药物测试、研究细胞分化等。,1 组织块原代培养,是比较常用的简易的原代培养方法，也是早期动物细胞培养方法。以培养瓶培养为例：（1）用吸管吸出组织块一一放入培养瓶内，一般每小块间隔为厘米，使其均匀贴在培养瓶的壁上。（2）然后将贴有组织块的瓶壁朝上，加入培养液，塞上瓶塞，倾斜置于37的CO2培养箱内培养2-4小时后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养。24小时后再补充培养液，一般3-5天更换培养液。（3）一般情况下，组织块贴壁后24小时细胞就从组织块四周长出，5-7天组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落，组织块四周的贴壁细胞也逐渐形成层片。,2 细胞原代培养,酶解制备单细胞 根
18、据不同的组织对象采用适当的酶消化液获得动物细胞进行培养。胚胎等组织细胞潜伏期短，第二天既可见生长，一周便可接连成片；成体组织来源的细胞潜伏期长，一般要一周左右。最常用的有胰蛋白酶和胶原酶，链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。EDTA适合消化传代细胞，常与胰蛋白酶一起使用,原代培养示意图,（六）动物细胞传代培养,传代培养（Passage culture/Subculturing）是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的。注意：每进行一次分离再培养称为传一代。这里的传代代数与细胞代数或倍增不同，“一代”是指从细胞接种培养到分离
19、再培养期间的一段时间。在细胞一代中，细胞约能倍增36次。,1 传代培养方法,悬浮生长的细胞可以采用加入新鲜培养基后直接吹打分散传代，或者采用自然沉降法加入新鲜培养基后再吹打分散进行传代。对于贴壁生长的动物细胞，原代培养细胞分裂增殖扩展成片后需要进行细胞分离重新接种培养。一般采用酶消化法进行传代培养。,酶消化的传代方法,吸出或者倒掉培养瓶内的旧培养液。加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底，轻轻摇动培养瓶。2-5分钟后检查，有细胞间隙变大、细胞质回缩现象时添加培养液终止消化。吸出消化液，加入Hanks液轻轻转动，洗去残留消化液。加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液。计数，接种进行传代
20、培养。,2 动物细胞培养的一般过程,动物细胞体外培养一般经过：组织获得与消化、接种、原代培养、传代培养几个环节,细胞培养过程分析,细胞计数活力分析细胞形态生化与分子分析倒置显微镜：组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。,1.细胞形态检查及活力分析：倒置显微镜下观察；四唑盐（MTT）法可以对细胞活力进行分析（活细胞的线粒体脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨（Formazan)并沉淀在细胞中）。2.pH及污染检查：含血清的新鲜培养液呈桃红色，pH在7.27.4之间。CO2的积累使培养液pH下降。当超出缓冲
21、范围时，培养液变黄，需34天更换一次培养液。CO2培养箱能自动控制5%的CO2含量。细菌污染时培养液变浑浊；支原体易透过滤器，污染不易被发现。,讨论与总结,讨论题：与植物细胞相比，动物细胞有什么特点？体外培养具有怎样的不同之处？你能预见动物细胞培养的生物反应器会有什么特殊设计？复习题1：动物细胞体外生长有什么特点？复习题2：目前动物细胞培养主要采用哪种类型培养基，为什么？复习题3：动物细胞原代培养有哪两种方法？复习题4：最常用的贴附型动物细胞传代方法是什么？有什么优点？,视频：动物细胞培养技术,下节课内容,动物细胞大规模培养技术1.细胞系2.动物细胞培养的生物反应器3.动物细胞大规模培养方法,
