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1、第三章基因的克隆方法,2,前言,基因是生物染色体上的一段DNA序列，具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能。,3,基因的表达过程,mRNA,翻译成蛋白质,基因组DNA,4,如何获得基因？,即基因的克隆方法,基于基因产物的基因克隆方法 基于基因加标签的基因克隆方法 基于基因序列的基因克隆方法 基于基因图谱的基因克隆方法,5,一、基于基因产物的基因克隆方法,mRNA,翻译成蛋白质,1、根据蛋白质序列克隆目的基因2、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因,6,原理：根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后设计探针或引物从基因组文库或cDNA文库中分离出相应的基因。,1、蛋白质
2、序列克隆法,7,实用性：分离纯化蛋白质十分困难,据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列,注意！密码子有简并性现象！,8,2、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因,基因表达的差异表现：,一是基因表达的种类的不同；,二是基因表达水平的改变。,9,差减杂交（SH）抑制性差减杂交（SSH）差异显示PCR（DD RT-PCR）DNA代表性差异分析（DNA RDA）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）cDNA微阵列,已发展的相应基因克隆方法：,10,差减杂交（SH）最早由Lamar和Palmer于1984年提出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究。,缺点：技术要求高，耗时，工作量大,11,SH在mRNA研究上的应
3、用机理：!,不足之处：重复性差，灵敏度低，回收的cDNA量有限。,12,基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；基因时空表达的研究：如根、茎、叶；不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。,差减杂交技术的应用方面：,13,1.2.2 抑制性差减杂交（SSH）,14,应用基因突变体的研究：如基因的表达与不表达基因时空表达的研究：如根、茎、叶不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照,15,1.2.3 差异显示PCR（DD RT-PCR）最先由Liang等于1992年报道，目前已广泛在实验室使用。主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3端设
4、计象5-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。,16,AATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT,17,18,具体操作：1、提取mRNA；2、特定引物（12分之一）反转录；3、特定引物和RP结合RT-PCR；4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较DNA带，从而找
5、出差别DNA。,19,缺点：,假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。工作量大。无法定量研究。扩出的条带往往是3端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。,20,优点：简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。所需的mRNA量少。各样本mRNA的差异可同时进行比较。扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。,21,二、基于基因加标签的基因克隆方法,原理：主要是在生物基因组中插入外源的一段DNA，使生物体产生某种突变表型，然后反过来利用这段外源已知的DNA片段来克隆基因的方法。,22,分类：T-DNA标签法 转座子标签法。,23,T-DNA标签法克隆基因技术路线：农杆菌侵染植物得
6、到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。建立突变体基因组文库及野生型基因组文库.用T-DNA片段做probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。,24,野生株,转基因株,25,转座子标签法 转座子又称转座因子或者跳跃因子，实际上也是DNA片段，它可以在生物的染色体组中移动，从染色体的一个位点跳到另一个位点，或从一条染色体跳到另一条染色体上，引起基因功能的改变。,26,转座子标签法最早是美国玉米育种家1951年发现，起初不被认同，1967年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证实后得到认同。根据DNA的结
7、构和转座的机理，分为两大家族：转座子和逆转座子，前者如玉米的Ac/Ds系统和spm因子，后者如果蝇的copia因子。,27,转座子根据结构不同可以分为简单转座子和复杂转座子简单转座子：可以直接插入到其他位置,也叫插入序列。复杂转座子：携带有其它基因或遗传标记。结构共同点：两端含有20-40个核苷酸的倒置重复序列。含有可编码转座酶的基因。应用：以Ac/Ds系统为例,28,Ac/Ds系统操作原理,把Ac，Ds分别转化并获得转化体。把Ac转化体同Ds转化体进行杂交得到F1代，然后自交得到F2、F3代分离群体，找出稳定突变个体。用Ds做probe筛选突变体文库获得突变基因的部分序列。用上述序列筛选正常
8、个体基因组文库或cDNA文库，得到目的基因。,29,三、基于基因序列的基因克隆方法,根据克隆的策略的不同，基于基因序列的基因克隆方法又可以分为两种形式：通过分子杂交克隆法和通过PCR扩增基因法,30,1、通过分子杂交克隆法原理：根据基因序列上的同源保守性，从一种生物中分离获得的基因用于制作分子探针，从另一种生物的基因文库中分离出此生物中的同源基因。,31,1）直接从基因组中扩增过程：,（1）提取基因组DNA作模板,（2）根据目的基因序列设计引物,（3）PCR扩增及产物鉴定,2、通过PCR扩增基因法原理：根据基因序列结构特征，设计基因特异引物，利用PCR技术直接从生物的基因组或是cDNA中扩增出
9、目的基因。,32,提取基因组DNA,PCR引物设计,真核生物基因组含有内含子！,此法适合扩增原核生物基因。,PCR扩增,基因序列分析,33,（1）提取基因组 total RNA,（2）反转录合成总cDNA作模板,（4）PCR扩增及序列分析,（3）根据目的基因序列设计引物,2）从mRNA中扩增:RT-PCR,原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。,适合扩增真核生物基因。,34,4、基于基因图谱的基因克隆方法,又称图位克隆法，是建立在拥有RFLP等分子标记的连锁遗传图和基因文库，基因产物未知的一种基因克隆技术，理论上可以分离任何一个突变基因。,35,染色体,分子标记A,分子标记B,目的基
10、因,阳性克隆,转化互补实验,基因图位克隆示意图,36,图位克隆基因的一般操作过程：通过遗传分析构建与目标基因紧密连锁的分子标记连锁图，达到基因的精细定位。用与目标基因紧密连锁的两侧分子标记筛选基因组文库，构建包含目标基因的基因组物理图谱。,37,基因组物理图谱,38,通过染色体步移或染色体登陆技术对目标基因进行进一步精细定位，得到阳性克隆。对阳性克隆转化隐性受体进行功能互补。基因序列测定及表达分析等。,39,影响基因图位克隆的因素：建立的分子标记遗传图中标记与基因之间的距离大小。基因组的大小及可能存在的大量的重复序列。基因组文库的大小及单克隆的大小。成功的例子：水稻Xa21拟南芥的RPM1，RPS2等。,40,图位克隆基因需满足的条件：较理想的遗传图谱和物理图谱，如SSR、RFLP图谱。大片段的基因组文库（BAC，PAC，TAC等）。遗传转化技术。,41,其它的基因克隆法,cDNA捕捉法RNAi：RNA干涉法酵母双杂交法。,42,思考题,请简单阐述SH在mRNA水平上克隆差异表达基因的机理。,
