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1、第八章-克隆基因的表达,第八章-克隆基因的表达第八章-克隆基因的表达第八章 克隆基因的表达,第八章 克隆基因的表达,遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程-中心法则。,一、基因表达：,二、克隆基因的表达：,外源基因在宿主细胞中表达。,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞。,三、制约目的基因表达的因素：,1.外源基因是否插入在正确的阅读框架,2.目的基因的有效转录（如启动子的作用）,3.mRNA的有效转录（如S-D序列等作用）,4.转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程,所谓表达体系，是由目的基因、表达载体与宿主细胞组成的完整体
2、系,四、在原核细胞内正确表达的基本条件：,必须能够正常地转录和翻译,1.外源基因不能带有间隔序列（内含子）,真核基因必须用cDNA或全化学合成基因，不能用基因组DNA,2.必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调 节元件控制外源基因的表达,3.外源基因和表达载体连接后，必须形成正确的阅读框架,阅读框架:由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列,4.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的 酶系统合成外源蛋白,表达载体：适合在受体细胞内表达外源基因的载体,5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因表达，防止外源 基因表达产物对宿主菌毒害,用原核生物作宿主,A dividing E.coli,
3、第一节 外源基因在原核细胞中的表达,原核或噬菌体启动子,MCS,SD序列,终止子,识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。,数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。,一、原核生物基因表达的特点,2.以操纵子为单位,1.只有一种RNA多聚酶,有意义链,5,反意义链,3,转录,mRNA,5,3,翻译,蛋白质,N,C,5,3,3.转录和翻译偶联、连续进行。,4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。,5.调控主要在转录水平上。,含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。,Shine-Dalgarno（S-D）seq
4、uence:,6.mRNA的核糖体结合位点,二、原核表达系统的注意事项,外源基因不能带有内含子,2.必须用cDNA,3.不能直接用真核基因组DNA,4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）,5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害,是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。,大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。,三、原核生物基因表达的调控,1.启动子,-35 Box 和-10 Box,（1）启动子序列,consensus sequences,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3,-10box（Pribnow Box）,TTGAC
5、A,TATAAT,转录起始位点,17bp,5,核糖体结合位点,RNA聚合酶 亚基的识别位点。,-35box,原核启动子共有序列的功能,（2）翻译的起始位点,核糖体结合位点（RBS）,1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：,mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。,ribosome binding site,SD,mRNA 5AGGAGGUAUG,16S rRNA3,UCCUCCA,S-D序列距离AUG的距离也影响翻译,AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）,位于SD序列下游。,ii）起始密码：,全酶是一个5聚体，含有两个小亚基，和2两个大亚基（和），一个亚基。,2.
6、RNA多聚酶,大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。,（1）结构,3.转录终止子,内终止子,intrinsic terminator：,E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。,在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子,启动子,操纵子,S-D序列,目的基因,终止子,由于茎环3段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。,原因：,反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作,茎环结构,多聚A/U,5-CC
7、CACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板),转录,5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA),RNA折叠,mRNA折叠,U C,C,U G,GC,AU,CG,CG,GC,CG,CG,GC,A A,CCCAC UUUU3,DNA,RNA聚合酶,脱落,大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。,4.翻译终止密码,5.翻译增强子,Translation enha
8、ncer,能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。,T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的区段。,21,必须是一种强启动子,能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。,应呈现低水平的基础转录,便于表达毒性蛋白等。,应是可诱导型的,用温度或化学试剂诱导。,（1）最佳启动子必须具备的条件,6.基因工程常用的原核启动子,来自大肠杆菌的乳糖操纵子。,用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。,Plac,O,目的基因,（2）乳糖启动子lac,阻遏物与操纵基因结合,四聚体的阻遏物,阻遏物与DN
9、A的结合,乳糖操纵子控制区的结构,阻遏物作用区CAP作用区RNA聚合酶作用区,组成：,长度：,203bp的HaeIII片断（包括-半乳糖苷酶的前8个密码）。,“可移动的lac启动子小片断”,IPTG有毒、昂贵，不理想。,IPTG=异丙基硫代-D半乳糖,（3）色氨酸启动子trp,trpR,P1,O,trpE,trpD,P2,trpC,trpB,trpA,trpR,阻遏蛋白基因；,P1,P2,启动子；,O,操纵基因；,衰减子,来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。,色氨酸操纵子,trpR,P1,O,trpE,trpD,P2,trpC,trpB,trpA,邻氨基苯甲酸合成酶,吲哚甘油磷酸合成酶,色氨酸合成酶,
10、链,链,分支酸,邻氨基苯甲酸,磷酸核糖基邻氨基苯甲酸,CDRP,吲哚甘油-磷酸,色氨酸,阻遏物,转录,（P1是主要启动子，P2的作用只有3%）,没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。,trpR,P1,O,trpE,trpD,P2,trpC,trpB,trpA,阻遏物,色氨酸,结合,不转录,用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分trpE基因。,P1,O,trpE,目的基因,有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录,（4）PL和PR启动子,是从噬菌体中得到的一类启动子，比lac启动子的活性高8-10倍
11、，比trp启动子活性高。,cIII,N,PL/OL,cI,PM,OR/PR,Cro,PE,cII,N:抗终止蛋白；Cro:抗阻遏蛋白(裂解必需的）；,cI,cII,cIII:阻遏蛋白；P:启动子；O:操纵子。,R:右；L:左,cIII,N,PL/OL,cI,PM,OR/PR,Cro,PE,cII,阻遏物,转录,转录,转录,当cI合成后，与OL和OR结合阻止RNA聚合酶，则左右基因都受到抑制。但促进PM使cI进一步转录。进入溶原期。,早期左边,早期右边,cI857:,表达载体常用的噬菌体启动子是PL。,调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的突变基因cI857。整合在宿主基因组里，或克隆到载体上
12、。,42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录,cI857,PL,外源基因,28oC时阻遏PL，外源基因不转录。,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,1.细胞质中表达,（1）包涵体（inclusion body）,是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。,形成原理未知。,在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human growth hormone,hGH）。,例：,使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞。,回收的蛋白生物活性差。,缺点,优点,2.周质中表达,（1）周质（periplasm）,格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。,蛋白质从细胞质转运到周质
13、的复杂机理目前不完全清楚,优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少、具有完全生物学活性的重组蛋白。,phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（lactamase）、肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等,（3）常用的原核信号肽,大肠杆菌的信号肽：,能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。,（2）信号肽（signal peptide）,一般位于N端。,鼠源RNase、人生长激素信号肽。,也能在细菌中起作用。,（2）真核信号肽,胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。,金黄色葡萄球菌的蛋白A。,枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶（endoglucanase）。,
14、由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。,用溶血素基因构建分泌性融合蛋白；,使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。,3.胞外表达,或与细菌素释放蛋白共表达。,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。,S-D序列,ATG-外源基因-TAG,优点:,五、几种类型的原核表达载体,1.非融合型表达载体,产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。,缺点：,容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。,哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。,（1）pKK223-3 载体,组成结构：,强启动子:tac（trp-lac）:,trp的-35区,l
15、acUV5的-10区,lac操纵基因,操纵基因：,乳糖操纵子系统。,终止子：,调节基因：,Lac I,宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如JM105菌,rrnB的强终止子,rrnB强终止子,S-D,插入位点区,S-D序列和插入位点区：,tac P,Lac O,S-D,插入位点区,rrnB T,宿主lac I,载体的其余部分：,来自pBR322质粒。,表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）,阻遏物,IPTG,必须选择一个有lacI的宿主菌。,条件：,载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。,如：pIN III系列：,2.分泌型表达载体,pIN III
16、-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,（1）组成结构,Ipp,lac P,lac O,S-D/ATG,ompa,插入位点,Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5 启动子。,调节基因：lac I S-D序列和起始密码ATG。分泌信号肽：,大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。,插入位点区（多克隆位点）。,强启动子：,pIN III-comA1,以pBR322为基础构建的。调节基因不必借助于宿主的lacI.,表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。,启动子：tac操纵基因：lacP调节基因：lacIS-D序列,3.融合蛋白表达载体系统-pGEX系列,
17、（1）优点,（2）组成结构,便于融合蛋白的分离和纯化。,22,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位点,TGA,lacP,ori：pBR322 ori融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。,（3）产物提纯,（4）产物分离,用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来,柱（column）,GST,外源蛋白,凝血酶,外源蛋白,柱（column）,GST,GST,洗脱,柱（column）,可再利用,pGEX,插入区：,pGEX-1T,CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA
18、TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGA,Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp,EcoR I,BamH I,凝血酶,CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACG,Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp,EcoR I,BamH I,凝血酶,ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGAC,Ile Glu Gly Arg Gly
19、 Ile Pro Gly Asn Ser Ser,EcoR I,BamH I,Xa因子,pGEX-2X的插入区：,pGEX-3X的插入区：,Sma I,Sma I,（5）其他融合蛋白系统,His-tag（组氨酸标签）：,在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。,His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,人胰岛素在大肠杆菌中的表达,溴化氰,Cyanogen bromide：,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3,-35box,-10box（Pribnow Box）,六、影响外源基因表达效率的因素,1.启动子的结构对表达效率的影响,
20、RNA聚合酶 亚基的识别位点,（1）一致顺序,（2）-35区与-10区之间的距离,间隔为17bp时，启动子最强。,（3）-35区和-10区的碱基顺序,越接近一致顺序，启动子越强。,5-TTGACA,TATAAT,一致顺序,lac,trp,PL,recA,tac I,tac II,5-TTTACA,TATGTT,5-TTGACA,TTAACT,5-TTGACA,GATACT,5-TTGATA,TATAAT,5-TTGACA,TATAAT,5-TTGACA,TTTAAT,-35box,-10box,5-AGGAGGU-3,S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）,翻译效率最高；如果是G（C）,效率
21、只有50%或25%。,2.转译起始序列对表达效率的影响,（1）S-D序列,？,AUG左侧的三个碱基也有影响。,（2）起始密码AUG,-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。,多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体结合位点有多个U。,（3）其它,3.启动子与外源基因之间的距离,转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。,增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。,4.转录终止区对表达效率的影响,5.载体拷贝
22、数及稳定性对表达效率的影响,6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响,但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。,选择强启动子序列，如tac 等,七、提高表达水平常用的方法,2.调整S-D序列与AUG碱基的距离,距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。,3.改变起始密码下面的几组密码子,一般为5-9bp。,能提高翻译的起始效率。,4.增加mRNA的拷贝数和稳定性,在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到35外切酶的攻击。,5.减轻宿主细胞的代谢负荷,合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。,将宿主生长代谢与外源基因表达分开。,（1）诱
23、导表达,一般采用温度诱导或药物诱导。,cI857阻遏物有活性，抑制PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。,28C:,42C:,cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。,cI857,PL,外源基因,PO,PL启动子是温度诱导型,调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。,无IPTG:,阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。,有IPTG:,阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。,tac启动子是药物诱导型,（2）表达载体诱导复制,将宿主的生长与载体的复制分开。,当宿主大量生长后，再
24、诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。,当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。,N末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。,（1）设计成融合蛋白,这是避免被降解的最好措施。,质粒基因产物,目的基因产物,N,C,切割,6.提高表达产物的稳定性,防止被宿主的酶降解。,Z系列载体：,ZUV5载体:,lac Z,G,AATTC,CTTAA,G,外源基因,Z2载体:,lac Z,GGG,AATTC,CCCTTAA,G,外源基因,Z3载体:,lac Z,GG,AATTC,CCTTAA,G,外源基因,提供三种融合插入阅读框。,使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。大
25、肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。,（2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解,减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。,（3）表达分泌蛋白,细胞质,外膜,内膜,周间质,质粒,染色体,细菌蛋白分泌的条件：,位于N端，一般为15-30aa。真核与原核的结构相似,功能相似，可以互换。,碱性氨基酸,N,疏水氨基酸核心区,切割位点,Arg、Lys,Leu、Ile,AlaGlySer,信号肽酶,外源蛋白,有信号肽。,细胞内的转运机制。,真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。,信号肽酶I
26、、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。,蛋白质内有与分泌相关的aa 序列。,为蛋白指明目的地。,23,八、细菌表达载体举例,colE ori,lacI,intein,CBD,MCS,T7Promotor,Ampr,M13 ori,rop,维持拷贝数,pTYB1，pTYB2，pTYB11，pTYB12,几丁质结合,1.pTYB1，pTYB2:intein在C端,pTYB系列E.coli表达载体：,pTYB1,pTYB2的 MCS,2.pTYB11，pTYB12:intein在N端,pTYB11,pTYB12的 MCS,利用Intein 分离纯化外源蛋白,Intein与Chitin柱结合,DTT
27、或-巯基乙醇或半胱氨酸能够诱导Intein的自我裂解活性,3.pTYB系列的特点,单柱一步纯化蛋白。,无需蛋白酶作用即可将目的蛋白与融合蛋白IPTG诱导的T7启动子,分离纯化出天然蛋白，不带有载体蛋白残基。,九、外源蛋白质表达后的正确修饰,分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。,1.形成正确的二硫键,人胰岛素分子,抗体分子,人血红蛋白分子,如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。,2.前体切割,（1）O-糖基化（Ser,Thr）,增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。,3.蛋白质糖基化,糖基,（2）N-糖基化（Asn）,Dol：长醇,Mannose：甘露糖,Gl
28、ucose：葡萄糖,N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖,磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化,4.氨基酸残基的修饰,羟脯氨酸,甲基组氨酸,羟赖氨酸,羧基谷氨酸,缺乏蛋白质的加工。（如糖基化、氨基酸修饰等）。,十、原核细胞表达的缺陷,酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。,第二节 外源基因在真核细胞中的表达,真核或病毒启动子,MCS,PolyA信号,终止子,外源基因,真核细胞表达体系表达外源具有以下特点：,真核细胞可识别并切除外源基因的内含子，从而成功表达目的多肽;,真核细胞内具有一系列剪切酶,2.真核基因在真核细胞中表达时，其S-D序列 与细胞核糖体RNA（rRNA）16S
29、亚基3末端 的互补程度较高，对翻译水平的调节有利;,3.在真核细胞内，由外源基因表达的蛋白 可被糖基化，成为糖蛋白，有利于保持 或提高免疫原性;,4.外源基因导入真核细胞的效率较低，其 在染色体DNA上的整合是随机的和自发 的，无法控制整合的位置和拷贝数;,5.真核细胞的培养要求较高，大量生产比 较困难，成本也高.,能在E.coli中克隆和扩增。,1.酵母克隆载体,一、在酵母中表达,Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;,有合适的克隆位点。,有酵母的选择标记,Ori,有大肠杆菌的选择标记,Ampr、Tetr。,Dividing Saccharomyces cerevisiae(bake
30、rs yeast)cells,由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段（选择标记）构成。,ColE1,酵母Leu 2+,如 PYeleu10:,（1）整合型载体(YIp),转化率低（1-10转化子/微克DNA）。,特点：,载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。,可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制。,不能在酵母细胞中自主复制,整合到酵母的染色体上,不能从酵母细胞中提取载体。,由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段(选择标记和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。,大肠杆菌质粒,酵母ARS,（2）复制型载体(YRp),酵母选择标记,ARS,ARS（automously replicati
31、ng sequence）:,ATTTTATATTTA,T G T,250bp,保守区,特点：,转化率高（102-103转化子/微克DNA)。,不稳定，容易丢失。,可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。,既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。,穿梭载体（shuttle vector）,在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。,特点：,YRp质粒,酵母着丝粒,（3）着丝粒质粒(YCp),不易从细胞中提取。,行为像染色体，能稳定遗传。单拷贝存在。,由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。,大肠杆菌质粒,酵母选择标记,2m质粒,如pYF92:,pBR322,2m,酵母his 3+,（
32、4）附加体型载体(YEp),2m质粒：,酿酒酵母的内源质粒，长度是2m。含有自主复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维持稳定）。,特点：,很高的转化活性（103-105转化子/微克DNA）拷贝数多（25-100分子/细胞）比YRp稳定,YEp24,Leu-酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2、PEG,整合到染色体上，或独立在酵母细胞内,转化,Leu营养缺陷型培养基筛选,转化子克隆生长,酵母载体,大肠杆菌,提取,插入外源基因,鉴定克隆,发酵表达,外源基因产物,分离、纯化,2.酵母转化和表达的一般过程,（1）优点,对其遗传学和生理学的研究比较深入。小量培养和大规模反应器中都能生长。已
33、经分离出很强的启动子。有翻译后的加工。本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯化。安全性高（FDA确认的安全生物），不需要 大量的宿主安全性检验。,3.酵母表达系统的特点,常常发生质粒丢失重组蛋白常常超糖基化,表达量普遍低,（2）缺点,每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖，,分泌困难。,正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。,分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙，,啤酒酵母不能识别和处理高等真核内含 子，必须使用cDNA,4.在啤酒酵母中表达的重组蛋白,24,（1）细胞质内表达,例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：,5.在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式,超氧化物,H+,H2O2,H2O,过氧化物酶,表
34、达出的SOD修饰正确：,起始氨基酸被切掉，第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。,SOD(超氧化物歧化酶),宿主：亮氨酸合成缺陷型酵母。,GAPD：甘油醛磷酸脱氢酶,（2）表达分泌型蛋白,在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。,方法：,构建载体,在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys-Arg相连。,前导肽（leader peptide）：,蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。,信号肽的切割：,前导肽,Lys-Arg,重组蛋白（水蛭素）,内切蛋白酶,6.其它酵母表达系统
35、,（1）乙肝表面抗原在嗜甲醇酵母中表达,在大型发酵反应器中容易生长；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总蛋白的40%！,嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点,HBsAg:乙肝表面抗原。可以作为疫苗。Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。3-aox1：整合到特定染色体的位点序列。,表达载体构建（整合型）：,诱导物：甲醇,产量：9106剂疫苗/240L发酵罐,整合到染色体中,（2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达,作为饲料添加剂促进反刍动物消化。,产量：10L，200h连续发酵产出50g溶菌酶
36、。,二、昆虫培养细胞表达系统,1.杆状病毒（Baculovirus）,广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。,（1）侵染周期：,两种形式,单独病毒粒子形式,病毒粒子,宿主细胞,病毒粒子,侵染,释放,病毒粒子,宿主细胞,侵染,宿主细胞,侵染,合成多角体蛋白,裂解,释放,多面体溶解,一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，ACMNPV）,多面体形式,（2）杆状病毒的表达特点,感染后36-48h，病毒开始合成大量的 多角蛋白。,多角蛋白的启动子特别强。多角蛋白基因可以被替换掉而不影响
37、病毒的繁殖。,多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。,3.转化子筛选,通过显微镜检查看是否有多面体形成。,源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。,2.最普遍应用的宿主细胞株,（1）转移载体的构建,大肠杆菌质粒，插入两段ACMNPV序列以供同源重组。,4.杆状病毒转化载体,杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入。,必须使用同源重组的办法。,多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号。,启动子与终止子之间插入多克隆位点,转移载体,（2）杆状病毒载体转化过程,转移载体中插入外源基因,转移载体与野生型ACMNPV
38、DNA共同转染宿主细胞,转移载体与病毒基因组发生双交换,外源基因被交换转入病毒基因组中,重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。,4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白,5.杆状病毒大规模表达存在的问题,杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。,（1）寿命短，不能连续合成重组蛋白,感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。,（2）共同转染率低,重组率更低。0.1%-1%。,6.构建可持续表达的载体,利用AcMNPV的一个早期基因IE1的启动子。IE1基因的转
39、录不依赖于病毒的其他基因产物，而且在昆虫细胞中表达正常。把外源基因插入到IE1启动子和IE1终止子之间。构成整合型载体。载体转染宿主细胞后随即整合到宿主染色体上，实现外源蛋白的持续表达。,载体,IE1启动子,外源基因,IE1终止子,载体,三、外源基因在植物中表达,根瘤,存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。,1.Ti质粒:,Ti plasmid,环状双链DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）,(相当于细菌染色体的3%-5%）。,（1）Ti质粒的结构,转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物
40、的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。,左边界,右边界,生长素基因,细胞分裂素基因,冠瘿碱合成,T-DNA（transfer-DNA）,生长素基因:,iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生长激素）的酶,iaaM:色氨酸-2-单加氧酶,色氨酸-2-单加氧酶,色氨酸,吲哚-3-乙酰胺,iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶,吲哚-3-乙酰胺水解酶,吲哚-3-乙酰胺,吲哚乙酸,细胞分裂素基因,tmr（ipt）：异戊烯转移酶,催化：,二磷酸异戊烯（IPP）,异戊烯酰嘌呤单磷酸（IPA）,5-AMP,章鱼碱（octopine),胭脂碱（nopaline）,N
41、H-(CH2)3-CH-COOH,NH,CH3-CH-COOH,HN=C,NH2,NH-(CH2)3-CH-COOH,NH,HOOC-(CH2)2-CH-COOH,HN=C,NH2,Arg与丙酮酸缩合成,Arg与酮戊二醛缩合成,冠瘿碱（opine）的类型和化学结构,农杆碱（agropine）,冠瘿碱（opine）的作用,冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。,Glu的二环糖衍生物。,毒性基因（vir）,决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，进入和整合。,vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱
42、离后，可与vir的产物VIR D2蛋白结合，并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助下穿过农杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。,单链的5端是右边界区域，含有25bp重复序列，参与整合。,章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：,不相容性基因,控制Ti质粒的不相容性。,冠瘿碱代谢基因,分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。,（1）第一步:植物受伤,植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。,2.农杆菌的感染和生存,（1）第二步 感染植物,（3）第三步 毒性基因（vir）表达,T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和
43、细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。,农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）,virA、virG、virD、virB,（4）第四步 T-DNA转移,T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。,（5）第五步 诱导冠瘿瘤,（6）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。,3.Ti质粒的种类,根据所编码的冠瘿碱（opine），分为,（1）章鱼碱（octopine)型质粒,（3）农杆碱（agropine）型质粒,（2）胭脂碱（nopaline）型质粒,裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（水稻、玉米）。,（1）能够自发地整合到植物的染色体上。（2）能转化多种植物。（3）强启
44、动子。,4.Ti质粒转化的对象,5.Ti质粒作为载体的可能性,T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。,（1）分子量太大（200kb）！（2）限制性酶切位点太多。（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。（4）在大肠杆菌中不能复制。,6.天然Ti质粒作载体的缺点,（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。,（5）加入大肠杆菌的复制起始位点和选择标记。,（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以及添 加polyA的信号序列。,（1）保留T-DNA的转移功能部分（边界）。（2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞
45、不再成为肿瘤，能正常分化。,7.Ti质粒的改造,8.Ti载体的类型,（1）共整合载体（cointegrate vectors）,最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850,需要同源重组才能插入外源基因。,pGV3850的特点（卸甲载体）：,是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。,卸甲载体：是解除武装的Ti质粒，删除了T-DNA上的onc基因和冠瘿碱合成酶基因等，其功能作为构建转化载体的受体质粒。中间表达载体：是含有植物特异启动子的中 间载体，其功能是作为构建转化载体的供体质粒。克隆在大肠杆菌中。转化
46、时，外源基因先克隆在中间表达载体上，再通过卸甲载体和中间表达载体的同源重组形成质粒的共合体。,外源基因插入pGV3850的过程,宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。,位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。,1）农杆菌选择标记,2）最终受体植物的选择标记,选择标记,卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）,三亲融合（三亲交配）法,含重组质粒的大肠杆菌：,含有外源基因和左右边界。E.coli菌株HB101,辅助细菌：,含辅助质粒。E.coli菌株GJ23（Kans）,受体农杆菌（空）：,三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素
47、抗性标记选择吸收了外源基因、左右界、和Vir的农杆菌。,三亲,外源基因,Kanr pBR322,土壤农杆菌含pGV3850,植物组织,卡那霉素筛选,胭脂碱筛选,抗卡那霉素的土壤农杆菌,外源基因表达鉴定,转化,插入,感染,pBR322与pGV3850重组,整合到染色体上,pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。,（2）双元载体（binary vectors）,既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。,Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。大幅度减小质粒的体积。（10kb）,双元载体的结构,精髓：Vi
48、r基因（转移）和左右界（整合）,目的基因载体,辅助Ti质粒,双元载体的转化,转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。,受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。,1）基因插入,2）帮助质粒（helper plasmid）,Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。,左,右,外源基因,Vir,帮助质粒,农杆菌,Vir,农杆菌,左,右,外源基因,感染植物,转化,左,右,外源基因,进入细胞核，整合，表达,四、在哺乳动物细胞中表达,1.动物细胞基因克隆和表达载体-SV40病毒,常用的SV40
49、载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改造而来的。,（1）SV40病毒的结构,20面体外壳：,由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白构成。,5243bp的环状双链。,DNA,SV40 Virus,SV40,猿猴细胞,细胞裂解,释放SV40,啮齿类细胞,细胞癌变,SV40DNA整合到寄主染色体上,permissive,nonpermissive,（2）SV40感染和生存方式,T-抗原（tumor antigen）:,两个6聚体的T抗原结合在SV40 DNA的复制起始点上，分别向相反方向移动，将双链DNA解螺旋。随后单链DNA结合蛋白（SSB）与解
50、开的单链DNA结合维持解旋状态。,(3)SV40DNA的复制,解链,SV40编码的蛋白。功能是在SV40 DNA复制的时候解开DNA双链。,T抗原,SV40 DNA双链,SV40 复制起始位点,5-CTCACTACTTCTGGAATAGC,3-GAGTGATGAAGACCTTATCG,1,20,早期回文序列,TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCT,AGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGA,21,47,T抗原结合位点,GCATAAATAAAAAAAATTAGTC,CGTATT TATTTT TTTTAATCAG,富含AT区,48,69,早期表达区：,(4)SV40病
