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1、序列分析软件DNAMAN 的使用方法简介,饶志明 博士/教授 博士生导师江南大学生物工程学院工业微生物中心江南大学工业生物技术教育部重点实验室E-mail:raozhm,DNAMAN 是一种常用的核酸序列分析软件。由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。,打开DNAMAN，可以看到如下界面：,第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，第二栏为工具栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作区左侧，可见Channel 工具条，DNAMAN 提供20 个Channel，点击Channel 工具条上相应的数字，即可击活相应的Channel。每个Channel 可以
2、装入一个序列。将要分析的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入Channel 中可以节约存取序列时间，加快分析速度。,如何使用DNAMAN 分析序列,1将待分析序列装入Channel 通过File Open 命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认Channel。通过Sequence/Load Sequence 菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel。通过Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（DNA 或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。,2 以不同形式显示序列,通
3、过Sequence/Display Sequence 命令打开对话框，根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。对话框选项说明如下：Sequence&Composition 显示序列和成分,2 以不同形式显示序列,Reverse Complement Sequence 显示待分析序列的反向互补序列 Reverse Sequence 显示待分析序列的反向序列 Complement Sequence 显示待分析序列的互补序列 Double Stranded Sequence 显示待分析序列的双链序列 RNA Sequence 显示待分析序列的对应RNA 序列,3DNA 序列的限制性酶切位点分
4、析,将待分析的序列装入Channel，点击要分析的Channel，然后通过Restriction/Analysis 命令打开对话框，参数说明如下：Results 分析结果显示其中包括：Show summary（显示概要）Show sites on sequence（在结果中显示酶切位点）Draw restriction map（显示限制性酶切图）Draw restriction pattern（显示限制性酶切模式图）,3DNA 序列的限制性酶切位点分析,Ignore enzymes with more than（忽略大于某设定值的酶切位点）Ignore enzymes with less th
5、an（忽略小于某设定值的酶切位点）Target DNA（目标DNA 特性）Circular（环型DNA），dam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）all DNA in Sequence Channel（选择此项，在Sequence Channel 中的所有序列将被分析，如果选择了Draw restriction pattern，那么当所有的channel 中共有两条DNA 时，则只能选择两个酶分析，如果共有三个以上DNA 时，则只能用一个酶分析。）,选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下列对话框：参数说明如下：Enzyme代表（enzyme data file）
6、，点击旁边的下拉按钮，出现两个默认选项，restrict.enz 和dnamane.enz，如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文件名。其中restrict.enz 数据文件包含180 种限制酶，dnamane.enz 数据文件包含2524 种限制酶。选择其中一个数据文件，相应的酶在左边的显示框中列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则对应的酶被选中，在右边空白框中列出。,要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例如puc18 multiple cloning sites），然后点击按钮出现下列对话框：输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可以方便分
7、析特定的酶切位点。Cutter 酶切识别序列长度；End 酶切产生的末端，其中包括，Blunt（平头末端），5Overhang（5突出粘性末端）,3Overhang(3突出粘性末端)，系统根据cutter 和end 的设定情况,在左边酶列表中显示符合条件的酶。最后，点击按钮执行操作。,4DNA 序列比对分析（Dot Matrix Comparision）,要比较两个序列，可以使用DNAMAN 提供的序列比对工具Dot Matrix Comparision（点矩阵比较）通过Sequense/Dot matrix comparision 命令打开比对界面，点击对比界面左上角的按钮，出现下列对话框：
8、,参数说明如下：,Sequence type 序列类型 Sequence 1 参加比对的第一序列选择框，框内选项说明如下：如果要比对的序列在Channel 中，点击下拉箭头，选择相应的Channel，则被选中的Channel 中的序列作为参加比对的第一序列；也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在File 选择框上点击即可。通过Length 选择参加比对的序列片段。Sequence 2 参加比对的第二序列选择框；选项说明同上 Show Sequence 选择此项，当同源性大于设定值时，将显示同源性；,Annotations 是否显示注释 Comparision 比对参数，其中Window 代表W
9、indow size（单位比对长度），Mismatch 代表Mismatch size（单位比对长度中许可的错配值）要快速比对，需将此项设为0。Both stran 代表Both strand（双链比对）选择此项，是指用Sequence 2 中的序列的正链和负链分别和Sequence 1 比较。Sequence 2 正链与Sequence 1 比较结果用黑色点表示，Sequence 2 负链比对结果用红色点表示。,Plot box 点阵图表显示参数，Position（起点坐标）Width（宽度值）Height（高度值）Frame size（边框线粗度值）Dot size（点粗度值）Gridli
10、ne（虚线框数）。参数设定好后，点击按钮执行操作。,5序列同源性分析,（1）两序列同源性分析通过Sequence/Two Sequence Alignment 命令打开对话框，如下所示：参数说明如下：Alignment method 比对方法，通常可选Quick(快速比对)或Smith&Waterman(最佳比对)，当选择快速比对时，设置较小的k-tuple 值，可以提高精确度，当序列较长时，一般要设置较大的k-tuple 值。k-tuple 值可选范围26；蛋白质序列：k-tuple 值可选范围13。,（2）多序列同源性分析,通过打开Sequence/Multiple Sequence Al
11、ignment 命令打开对话框，参数说明如下：File 从文件中选择参加比对的序列Folder 从文件夹中选择参加比对的序列Channel 从channel 中选择参加比对的序列 Dbase 从数据库中选择参加比对的序列 Remove 清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的序列名选择）Clear 清除全部序列,点击按钮，出现方法选择对话框：选择其中一种方法，点击按钮，出现下列对话框：如果在前一对话框选择的是Fast alignment,则在此对话框中选择Quick alignment,否则选择 Dynamic alignment 即可。其它参数不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值。
12、点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特性选项。点击按钮下的按钮，出现下列选择项：可以通过这些选项，绘制同源关系图（例如Tree/homology tree 命令）。显示蛋白质二级结构（Protein Secondary Structure 命令），绘制限制性酶切图（Restriction Analysis 命令）等。,6.PCR 引物设计,首先，将目标DNA 片段装入Channel,并激活Channel。点击主菜单栏中的Primer 主菜单，出现下拉菜单，点击Design PCR Primers for DNA 命令，出现下列对话框：参数说明如下：Primer locatio
13、ns on target 引物定位 其中包括下列选项：Product size（扩增目的片段大小）Sense primer(正向引物选择区)Antisense primer(反向引物选择区)Primer 引物特性包括Length(引物长度)，Tm 值,GC 含量等参数；Reject primer 引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）,包括下列选项：3dimer(可形成3端自我互补的碱基数)Hairpin stem(可形成发卡颈环结构的碱基数)PolyN(多聚碱基)3Uique(3端严格配对碱基数)All matches(引物互补配对百分数)Consentrations 浓度设定Produ
14、ct for hybridyzatPCR 产物用于Southern Blot 探针杂交,7画质粒模式图,我们常常要用到各种质粒图，无论是制作幻灯片，还是发表文章，常常需要质粒图。DNAMAN 提供强大的绘质粒图功能，能满足我们的需要。通过Restriction/Draw map 命令打开质粒绘图界面：将鼠标移动到圆圈上，等鼠标变形成“I”时，单击鼠标左键，出现如下菜单：菜单说明如下：Position 当前位置Add Site 添加酶切位点Add Element 添加要素Add Text 添加文字Insert Fragment 插入片断Copy Fragment 复制片断Cut Fragment
15、 剪切片断 Remove Fragment 清除片断Frame Thickness 边框线粗细调节,点击Add Site 选项，出现对话框：参数说明如下：Name 要添加的酶切位点的名称(例如HindIII)Position 位置（以碱基数表示）点击Add Element 选项，出现如下对话框：参数说明如下：Type 要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切换）Color/Pattern 填充色（共有16 种颜色供选择）Name 要素名称Start/End/Size 要素起点/终点/粗细度,核酸序列的一般分析流程,1.1 核酸序列的检索 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov:80
16、/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide 1.2 核酸序列的同源性分析 1.2.1 基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析 http:/1.2.2 核酸序列的两两比较 1.2.3 核酸序列的批量联网同源性分析(方案),1.3 核酸序列的电子延伸 1.3.1 利用UniGene数据库进行电子延伸(方案)1.3.2 利用Tigem的EST Machine进行电子延伸 EST Extractor:http:/|EST Assembly:http:/www.tigem/ESTmachine.html 1.3.3 利用THC数据库对核酸序列进行电子延伸 http:/,1
17、.4 核酸序列的开放阅读框架分析 基于NCBI/ORF finder的ORF分析 http:/1.5 基因的电子表达谱分析 1.5.1 利用UniGene数据库进行电子表达谱分析（方案）利用Tigem的电子原位杂交服务器进行电子表达谱分析 http:/,1.6 核酸序列的电子基因定位分析 1.6.1 利用STS数据库进行电子基因定位 http:/1.6.2 利用UniGene数据库进行电子基因定位（方案）,1.7 cDNA的基因组序列分析 1.7.1 通过从NCBI查询部分基因组数据库进行基因组序列的分析(方案)1.7.2 通过从NCBI查询全部基因组数据库进行基因组序列的分析 http:/=
18、HsBlast.html&ORG=Hs 1.7.3 通过从Sanger Centre查询基因组数据库进行基因组序列的分析 http:/,1.8 基因组序列的初步分析 1.8.1 基因组序列的内含子/外显子分析 http:/1.8.2 基因组序列的启动子分析 http:/www-,1.9核酸序列的注册 1.9.1 EST序列的注册(方案)1.9.2 较长或全长cDNA序列的注册(方案)1.10待分析序列所对应的已知克隆的获取 http:/,引 物 设 计,引物引物的重要性引物设计的原则引物与PCR引物设计软件如何使用Primer Premier 5.0引物同源性分析,引物（primers),引物
19、是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。,3,3,5,5,Sense primer,Antisense primer,引物的重要性,在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。,引物设计原则,引物长度 碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3端引物5端引物的内部稳定性引物的保守性与特异性扩增区域的二级结构,引物长度,一般为15-30个核苷酸，在做
20、长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。,碱基分布的均衡性,同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般40-60%GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。,引物Tm值,一般要求：55-65。计算：对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm=H/(S+R*ln(C/4)+16.6 log(K+/(1+0.7 K+)-273.15,引物二级
21、结构,引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。,引物3端,引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。,引物5端,引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5端标记放射性元素
22、或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。,引物的内部稳定性,过去认为，引物3端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3端最好为G或C。现在的观点认为，引物的5端应是相对稳定结构，而3端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3端尽可能选用A或T，少用G或C。仅仅3端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。如果3端为富含G、C的结构，只需3端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。,引物的保守性与特异性,保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增,扩增区域的二级结构,模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物
23、时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。扩增区域的自由能（G。）小于58.61kJ/mol引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30Tm product=81.5+16.6 log(K+/(1+0.7K+)+0.41(%G+%C)-500/length,引物与PCR,引物浓度：一般为引物浓度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2O VH2O(单位：L)退火温度最适退火温度（Ta Opt）=0.3(Tm of primer)+0.7(Tm of product)25一般采用较引物Tm值低5作为PCR退火温度。,引物设计软件,Primer Premier 5.0
24、 生物软件网下载安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。Oligoprimer 3The Primer GeneratorDNAMAN,如何使用Primer Premier 5.0,引物设计一般引物设计5带酶切位点引物设计巢式PCR引物设计多重PCR引物设计探针设计引物评析,引物同源性分析,用Blastn软件进行同源性比较尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物选择3端与非目的基因不同源的序列作为引物选择两个引物3端与同一非目的基因不同源的序列作为引物,设计题目一 xx微生物xx酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达,目的基因编码如
25、耐高温-淀粉酶、生淀粉酶、普鲁兰酶、植酸酶、碱性甘露聚糖酶、脂肪酶、碱性蛋白酶、谷氨酰胺转移酶、木聚糖酶、纤维素降解酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶、荧光素酶、葡萄糖苷酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、已糖激酶、葡萄-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、吡喃葡萄糖激酶、单宁酶,表达载体：pET28a（+）-E.coli要求：找到具体某一原核生物的某一编码基因的全序列，利用分析件进行目的基因内部限制性内切酶的酶切分析及5和3末端引物的设计提交具体的实验方案（从提取全基因组DNA到目的基因克隆,与表达载体的重组、表达及活性分析）讨论，优化实验方案,好的设计方案成功的一半,要求提交打印稿和相应电子版下学期第2周内完成（约3月15日左右）鼓励提前完成各个小组派一个代表报告其实验方案，全班同学对其进行讨论，找出不足和欠缺之处，并加以改正。,方案设计报告按照研究论文格式,标题作者摘要前言材料和方法结果与讨论参考文献,Thanks！,
