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1、白血病分子诊断技术,康圣环球医学特检集团 周 荣,WH0血液肿瘤分类方案（1999年）,新分类方案的基本原则是：结合形态学、免疫表型、遗传改变和临床特征来鉴定疾病的“真实本质”。提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性，开启了血液肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代。,形态学,免疫学,细胞遗传学,WH0血液肿瘤分类方案（2008年）,组织,蛋白,细胞,基因,白血病分子诊断的意义,精确诊断准确预后指导治疗科研资料,白血病初发,MICM诊断,系统诊断,异常标记,残留监测,靶向治疗,WHO血液肿瘤新分类实验技术平台,实施WHO血液肿瘤新分类方案高度依赖流式细胞、细胞遗传和分子生物学实验技术平台
2、以及更为重要的掌握这类实验技能并具有血液肿瘤专业知识的血液病理学医师。,遗传工作站,流式细胞,基因平台,基因检测 融合基因 基因突变,“二次打击”学说,D.Gary Gilliland Best Practice 16:409-417,基因突变,融合基因,白血病发生,CML Indications for Diagnostic TestsMilestones and Monitoring in Patients with CML Treated with Imatinib(2008 ASH Education Program Book p420)TestIndicationPhysical E
3、xamDiagnosis/StagingEvery three month until resolution of splenomegalySuspected progression or resistanceComplete Blood Count Diagnosis/StagingEvery 1-2 weeks until blood count have stabilized,then at 6 weeks intervalsSuspected progression or resistanceBone Marrow KaryotypingDiagnosis/Staging6,12,18
4、 months or until complete cytogenetic responseSuspected progression or resistanceQuantitative PCR for Bcr-Abl Every three months once CCyR(complete cytogenetic response)documentedFISH for BCR-ABL Uncertain Diagnosis(typical clinical presentation,but metaphase(peripheral blood)cytogenetics not succes
5、sful,or Ph chromosome negative)Every 3 months if no access to high quantitative PCR monitoringQualitative(low sensitivity)Uncertain Diagnosis(typical clinical presentation,but metaphase PCR for BCR-ABL cytogenetics not successful,or Ph chromosome negative)BCR-ABL Kinase Mutation Screen Suspected pro
6、gression or resistance,Molecular Measurements of Treatment ResponseClinical Application(2008 ASH Education Program Book p367)Application Action Detect poor early treatment responseTreatment intensification Detect good early treatment responseTreatment deintensification Detect relapseTreatment intens
7、ification Prepare for HSCT Measure MRD before HSCT Optimize timing of HSCT Measure MRD after HSCT Modulate immunosupressionDLI,etc.Measure MRD at end of clinical trial Evaluate the result of novel anti-ALL agents or therapy,分子诊断在白血病诊断中的应用,提供早期辅助诊断及预后判断对治疗过程进行跟踪进行白血病治疗后的微小残留检测,各病例中的具体应用,AMLCML ALLCLL
8、 淋巴瘤,AML病例中应用,t(8;21)(q22;q22)AML1-ETO t(15;17)(q22;q21)PML-RARa inv(16)(p13;q22)CBFB-MYH11 AML融合基因全套检测FLT3基因突变检测NPM1基因突变检测c-kit/D816V突变检测CEBPA基因突变检测WT1基因表达定量检测,t(8;21)(q22;q22)AML1-ETO 融合基因,t(8;21)出现在大约7%的AML病例中，在年青的患者中更为常见。其主要出现在AML-M2这一亚型中，大约有20-40%的病例具有t(8;21)。AML1-ETO 融合基因出现在所有的t(8;21)阳性的AML中，同
9、时也出现在具有复杂易位的t(8;21)阴性的AML病例中。t(8;21)易位是一个较好的标志。,PML-RAR,APL是一类临床凶险的急性白血病，常见广泛的严重的出血，以颅内出血最为严重。1、t（15;17)，是APL特有的遗传学标志。（70%-90%的APL存在）2、由于PML基因上融合位点的不同，分为bcr1(55%)、bcr2(4%)、bcr3(40%)三种融合型。3、PML-RARa 融合基因（+）的患者，可使用全反式维甲酸并提示预后复发。该基因阳性的病人，可用于疗效监测和微小残留的检测。,inv(16)(p13;q22)CBFB-MYH11融合基因,Inv(16)(p13;q22)或
10、t(16;16)(p13;q22)通常见于AML-M4Eo亚型，占总AML患者的10%。inv(16)(p13;q22)的病人通常有较好的预后。,AML相关基因全套筛查,基因突变检测 AML 患者预后判断 C-Kit、FLT3、NPM1、CEBPA,染色体核型正常的AML患者,CEBPA(15%),Molecular Markers additional to cytogenetics with independent prognostic significances as regarding remission duration or survival in AML of adultsAML
11、:Challenge of Capturing Diesease Variety(2008 ASH Education Program Book p3)PrognosisGeneGene mutation withCEPBAmutfavorable impact NMP1mut but FLD3-ITDnegGene mutation withKITunfavorable impactFLD3-ITD but no NMP1mut MLL-PTD*(5-10%of normal karyotype AML)WT-1*among normal karyotype AML,AML患者4种基因突变检
12、测小结,WT1定量检测 MDS/AML监测指标,WT1基因在AML和MDS病人中经常异常高表达，与AML和MDS的发生和进展，以及凶险判断，疗效跟踪和预后复发判断有非常密切的关系。通过定量PCR检测WT1的表达能够有助于AML和MDS病人的风险判断，疗效跟踪和预后复发的判断。,WT1在正常标本和AML病例中的表达情况,正常骨髓,患者骨髓,基因检测 CMPD诊断,在WHO2008分类系统中，将有无JAK2突变列为主要的诊断指标：如果JAK2突变阳性，血红蛋白增加，骨髓红系细胞明显增加，就可以诊断真性红细胞增多症（PV），即使患者就诊时血红蛋白低于以往WHO所规定的指标值，但却持续超过正常值20g
13、/l，也可以确诊PV。如果JAK2突变阳性，血小板仅仅持续大于450*109/L，骨髓巨核细胞增生，可以诊断原发性血小板增多（ET）。,PV/ET诊断,FIP1L1-PDGFRA部分高嗜酸性粒细胞综合征（HES）患者含有FIP1L1-PDGFRA融合基因，FIP1L1-PDGFRA有持续活化的酪氨酸激酶活性，对酪氨酸激酶抑制剂非常敏感，可用格列卫治疗。ETV6-PDGFRB有少部分CMPD病例（BCR-ABL阴性）的PDGFRB基因持续性活化表达，格列卫能够特异性的抑制ETV6-PDGFRB的酪氨酸激酶活性，携带该融合基因的CMPD病例可以选择格列卫治疗。,CML病例中的应用,BCR-ABL融
14、合基因检测：t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL p210 t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL p230 BCR-ABL融合基因ABL激酶突变检测,BCR-ABL融合基因,超过95%的CML病例中存在BCR-ABL融合基因 P210型 M-bcr（绝大多数）b3-a2（55%）b2-a2（40%）b3-a2和b2-a2（5%）b3-a3（罕见）b2-a3（罕见）p230型 u-bcr e19-a2（罕见）,定性检测：RT-PCR,定量检测：QRT-PCR,定性检测报告模板,定量检测报告,BCR-ABL融合基因ABL激酶突变检测,ABL激酶突变会引起伊马替尼治疗耐药 T31
15、5I 耐药机制:T315突变后不能与伊马替尼形成关键性的氢键，可完全阻断伊马替尼与ABL激酶区的结合,从而耐药。P环的突变(244-255)耐药机制：如 Y253FH、E255KV、Q252H、G250E等通过改变ABL激酶的空间构象，亦可阻碍伊马替尼与之结合。,A环突变(381-402)一般提高用药量可以降低耐药程度。其它突变 对于耐药程度较弱的突变，如M244V、G250E、F317L、E355G、F359V及V379I等，通过提高药物剂量，可以克服耐药。,报告模板,ALL病例中应用,t(1;19)(q23;p13)E2A-PBX1 t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4 t(12
16、;21)(p13;q22)TEL-AML1t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL ALL相关基因全套检测,t(1;19)(q23;p13)E2A-PBX1融合基因,t(1;19)(q23;p13)易位可以在5-6%的儿童ALL病例和3%的成人ALL病例检测到。这一易位几乎全部出现在前B细胞ALL病例中。携带有该易位的病人，其临床症状都比较凶险。,t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4 融合基因,在50-70%的婴幼儿ALL和将近5%的小儿和成人ALL病例中有MLL-AF4 融合基因。t(4;11)(q21;q23)与前B-ALL相关。在婴幼儿ALL中MLL-AF4 融合基因被认
17、为是预后不好的标志。在成人ALL中也是一个坏的标志，但对于成人ALL，该融合基因的存在似乎能增强高剂量的阿糖胞苷（Ara-c）的疗效。,t(12;21)(p13;q22)TEL-AML1融合基因,t(12;21)(p13;q22)是儿童ALL中最为常见的易位，几乎25%的小儿ALL有该易位。其主要的阳性病人出现在1-12岁之间，其中2-5岁这个年龄段最多。所有的病例其免疫分型都是前B细胞ALL。t(12;21)阳性的病人都有较好的预后，其复发的时间也会较晚。,t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL 融合基因,Ph染色体在5%的小儿ALL和20-50%（随年龄增加比例也增加）的成人ALL
18、中也可见。在Ph+的ALL中40%的BCR-ABL融合基因是p210型的，60%是p190型的。在ALL中，PH阳性和随之出现的BCR-ABL融合基因是一个非常不好的标志。,ALL相关基因全套检测,CLL病例中的应用,IgVH基因重排检测：IgVH突变状态：按照细胞IgVH的突变状态可以将CLL分为突变的CLL（M-CLL）与未突变的CLL(U-CLL)。前者预后较好。而后者则疾病进展快，生存期短。,IgVH基因重排阳性的CLL患者预后较好,融合基因套系,白血病31种融合基因筛查,其它检测项目,TCR/IgH重排BCL-1/JH、BCL-2/JH检测,IGH与TCR重排,淋巴细胞克隆性的检测对
19、鉴别良、恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值。,单克隆重排：淋巴细胞异常标志多克隆性重排：淋巴细胞正常生长发育,IgH基因,TCR基因,T细胞,B细胞,重排,成熟B细胞,成熟T细胞,ALL、CLL、淋巴瘤辅助诊断 CLL预后判断,ALL、CLL、淋巴瘤辅助诊断,BCL-1/JH检测,BCL-1/JH t(11;14)(q13;q32)基因重排主要发生在套细胞淋巴瘤（MCL）当中,在60-70%的MCL病例中有该易位的存在，检测BCL-1/JH基因重排可帮助鉴别诊断套细胞淋巴瘤。,BCL-2/JH t(14;18)易位是B细胞淋巴瘤的特有性变异，90%的滤泡性淋巴瘤和20-30%的弥漫性大B细胞淋巴
20、瘤含有此易位。,BCL-2/JH检测,标本要求,骨髓2-3ml或外周血3-5mL（复发和 微小残留的检测：骨髓2-3ml）EDTA抗凝（紫头管），4，24h内送检。,细胞遗传学 染色体核型分析 FISH,染色体核型分析,适应症 1.造血系统疾病初诊 2.末次化疗结束两周以上意义 对恶性血液病的诊断，分类分型，治疗方案选择，疗效评估和预后预测方面都有重要的价值。,46，XY,t(9;22)(q34;q11),约占95%CML Ph染色体,染色体核型分析 诊断,8三体单独或附加异常，较多见于M1，M4，M5，预后差或中等,46,XY,+8,FISH检测,荧光标记的DNA探针,原位杂交,荧光显微镜检
21、测,FISH相对于染色体检测，灵敏度高，特异性高。可以弥补染色体不足，染色体检测为阴性，FISH可能为阳性。患者用药后，染色体阳性率较低，FISH可提高检出率。,染色体核型与FISH,变异型h（复杂遮蔽型）易位,FISH探针：BCR/ABL,检测结果nuc ish 9q34(ABL2),22q34(BCR2)(ABL con BCR 1)200/400,正常FISH组合结果，中位生存期约为111个月。,FISH探针套系：CLL,FISH探针套系：MM,FISH探针套系：MDS,标本要求 骨髓35ml，肝素钠抗凝绿头管。全血3-5ml（外周血原始细胞30%），肝素钠抗凝，48小时内，4送检，详细
22、填写申请单。,70,病例一：AML,病例资料：女，3岁，2009.6 初发FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析，原始细胞分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的26%，主要表达HLA-DR、CD13、CD15、CD33、CD34、CD38、CD117，（CD19+2.27%）。淋巴细胞比例降低。提示：急性髓系细胞白血病（AML-M2可能）。基因：AML1/ETO 阳性。,71,2009.7 化疗 D33：FCM：可见残留，CD33+CD19+细胞约占0.04%。基因：AML1/ETO 阳性。,72,2009.9 D70：FCM：未做。基因：AML1/ETO 阴性。2010.3 D245：FCM：未见免疫表型明显异常的细胞。基因：AML1/ETO 阴性。,73,病例资料：病人陈某，2008年2月在协和医院确诊CML。BCR-ABL定量检测为阳性。格列卫治疗。,病例二：CML,谢谢大家！,关注健康 关注康圣环球,
