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1、第二讲 基因组序列诠释,5.转录物组6.蛋白质组,问题细胞周期的不同时期个体发育不同阶段不同的器官和组织不同的外界环境下 各种基因的表达与否、量的差异、表达部位如何,5.转录物组5.1 Northern杂交杂交主要步骤：提取总RNA（不同组织、不同器官）变性电泳 制备目的基因探针 转移尼龙膜（放射性 或 化学标记法）杂 交 扫描或放射自显影 依据杂交信号的强弱、有无判断基因的表达部位、表达量、表达时期等,5.2 SAGESAGE（serials analysis of gene expression）基因表达系列分析 1995 Velculescu 及其同事年创立,SAGE特点：进行转录物组研
2、究，也就是转录水平的研究；通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表达信息；SAGE区别于差异显示、消减杂交等其它技术的主要特点是可用于寻找那些较低丰度的转录物，最大限度地收集基因组的基因表达信息，这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的首选策略；SAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建，对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较，特别是对疾病组织与正常组织的比较发展迅速；,SAGE 技术的主要理论依据：来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列（911bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够
3、信息，可作为区别转录物的标签（tag）；通过简单的方法将这些标签串联在一起，形成大量多联体（concatemer），对每个克隆到载体的多联体进行测序，并应用SAGE软件分析，可确定表达的基因种类，并可根据标签出现的频率确定基因的表达风度（abundance）。,SAGE 步骤,SAGE实例,5.3 基因芯片,何为生物芯片?生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义 的科学技术革命。,生物芯片分类,基因芯片技术是指通过微阵列(Microarray)
4、技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。,基因芯片,基因芯片发展历史,Southern&Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,基因芯片的主要应用基因表达检测 拟南芥、酵母基因表达研究等突变检测 BRCA基因外显子、CFTR基因、-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等基因组多态性分析 人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分系析，人线粒体16.6kb基因组
5、多态性的研究等基因文库作图 通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图,Types of DNA Chips,基因芯片研制的总体蓝图,研制方向的确定,基因组序列分析与待检基因探针序列的确定,检测样品 的制备,探针阵列的准备,检测设备的研制,杂交检测与数据分析,表达芯片的制备检测流程,表达芯片实例,PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库扩增产物,扩增产物点样于包被的玻片上,DNA 芯片,热击T细胞cDNA,未处理的细胞cDNA,杂交 杂交,激光共聚焦扫描,发现17个差异表达基因,11个被热诱导,6个被热抑制,发现其中3个为未发现的新基因,6.蛋白质组,DNA,mRNA,PROTEIN(活性),
6、转录水平调控(transcriptional control),翻译水平调控(Translational control),翻译后水平调控(Post-translational control),6.1蛋白质组(Proteome),Proteome来源于 Proteins和 genome 两个词的组合,意思是Proteins expressed by a genome,即基因组表达的蛋白质.,蛋白质组定义 广义上是指某种细胞或组织中基因组表达的所有蛋白质;狭义上,可以指不同时期细胞内蛋白质的变化.蛋白质组学定义 研究蛋白质组结构和功能的领域称为蛋白质组学.蛋白质组学的研究内容:分析全部蛋白质组
7、所有成分以及它们的数量;确定各种组分所在的空间位置、修饰方法、互作机制、生物活性和特定功能等,6.2 蛋白质组分析复杂性,蛋白质有许多加工方式,如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等；mRNA 的可变剪接、程序性移码和可控突变，1个基因可编码许多不同的蛋白质，常常表现为组织特异性；蛋白质之间存在大量的相互作用，如形成同源或异源二聚体、三聚体或多聚体，不同的结合状态有不同的活性；1种蛋白质可参与多种反应，或多种蛋白质参与1种反应。,6.3蛋白质组研究技术,蛋白质组主要研究技术：双向电泳 生物质谱技术 蛋白质芯片 酵母双杂交,6.3.1 双向凝胶电泳 样品制备（包括蛋白质的溶解、变性及还原，从而去除非
8、蛋白质杂质等）第一向等电聚焦（根据蛋白质电荷差异进行分离）第二向SDS-PAGE（以蛋白质分子量差异为基础）蛋白质的检测（用考马斯亮蓝、银染、铜染等方法）图谱数字化分析（图象扫描、确定每个蛋白质点的等电点和分子量，寻找差异蛋白）,6.3.2 蛋白质组分析技术 主要蛋白质组分析技术：质谱方法 蛋白质序列分析 氨基酸组成分析,质谱技术的基本原理：样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量。质谱仪组成：进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成。,质谱技术在蛋白组研究中的应用：A 肽质谱和肽序列分析 蛋白质经双向电泳后，分离到的蛋白质被切割下来，进行胶
9、内酶解，或转移到PVDF膜上，进行膜上膜解，然后上样进行测序。但目前质谱法还不能够取代Edman降解法测序，可是其测定速度较快。,B 鉴定翻译后修饰的蛋白质 质谱可通过特征离子监测的方法很快确定磷酸化肽，通过串联质谱确定磷酸化位点；质谱可与蛋白酶解和糖苷酶酶解结合，寻找糖肽，鉴定糖基化位点；质谱还参与糖链组成、结构甚至分支情况等的分析。,C 质谱技术的其他作用 质谱可对蛋白质二硫键进行定量和定位，分析蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质与其他分子的相互作用，以及蛋白质的二级结构等。,6.4蛋白质组数据库的建立和生物信息学 数据库的建立是蛋白质组研究的最重要的一个方面。蛋白质的数据库包括：蛋白质序列
10、数据库 质谱数据库 双向电泳图谱数据库 有关蛋白质结构的数据库,6.5 与疾病相关蛋白质研究的基本策略,6.6 蛋白质组研究的目的,建立蛋白质互作网络为人们了解生物体的各个生长、发育期的各个蛋白质有机组成、协作，更完整的解释各种生命现象奠定基础促进人类疾病的治疗,本章要点,已知一个DNA片段，如何预测其开放读码框?RACE技术的基本原理是什么?动物园杂交的原理基因剔除法RNAi的作用原理及应用酵母双列杂交的原理SAGE 的基本原理及技术路线什么是蛋白质组、蛋白质组学，以及蛋白质组的研究目的和意义？,第三章 物理作图(physical mapping),物理作图:应用分子生物学技术直接将DNA分
11、子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置物理图的距离:依作图方法而异,辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR);限制性片段作图与克隆作图的图距单位为碱基对(bp),物理作图的方法,限制酶作图(Restriction Mapping)依靠克隆的基因组作图(clone-based mapping)荧光原位杂交(Fish,Fluorescent in situ hybridization)序标位作图(STS，Sequence taged site),1.限制性作图 它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置.其只能应用于较小的DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率.通常采用的6碱基对识别
12、顺序的限制酶仅适合50Kb以下DNA分子的精确作图.,1.1 限制酶作图(Restriction Mapping)基本原理,1Kb,EcoR I,待检的DNA,BamHI,15Kb,6Kb,5Kb,10Kb,9Kb,E,B,B,H,H,E,H,H,H,H,E+B,E,B,6Kb,E,H,4Kb,E,B,5Kb,B,H,跨叠克隆群(Contig),酶切位点,1.2 限制酶作图的改进脉冲凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis)稀有切点限制图绘制,稀有切点限制图绘制注意事项:识别顺序越长产生的片段越大;识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小;如人类基因组A/T比例
13、接近60/%,选用高比例A/T位点限制酶,产生的片段多于高比例G/C识别位点酶 有些限制酶识别位点较长 如酵母的-Sce识别顺序为18bp,如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入代测基因组中.基因组DNA 的甲基化状态 如人类活细胞基因组中大量5-CG-3顺序的胞嘧啶被甲基化,使许多含有5-CG-3顺序的内切酶很少找到可切位点.,2.1 大片段DNA的克隆载体 YAC:酵母人工染色体 230-1700Kb BAC:细菌人工染色体 300Kb PAC:P1人工染色体 300Kb Fosmids:30Kb,2.基于克隆的基因组作图,2.2 重叠群组建重叠群:相
14、互重叠的DNA片段组成的物理图.重叠群的组建方法 染色体步移法,指纹作图法 指纹:系指确定DNA样品所具有的DNA片段;一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征.常用的指纹分析方法:A 限制性带型(restriction patterns)指纹 B 重复顺序DNA指纹(repetitive DNA fingerprints)C STS目录作图(STS content mapping)D 重复DNA PCR(repetitive DNA PCR)或分散重 复顺序PCR(interspersed repeat element PCR,IRE-PCR)指纹,3.荧光原位杂交(Fish,Flu
15、orescent in situ hybridization),将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。,用DNA纤维分析水稻第4号染色体,4.序标位作图(STS,Sequence Taged Site),长度:100-500 bp序列已知,可以设计PCR反应单拷贝,在染色体上的位置是唯一的EST(Expressed sequence tag)大部分可以作STS,4.1 STS作图原理,4.2 寻找STS的方法:表达顺序标签(expressed sequence tag，EST)从cDNA中找到的小段顺序,但基因家族成员间共有的序列不
16、能用于STS。SSLP（simple sequence length polymorphisrns，SSLPs）随机基因组顺序,EST1990年，Brenneer等首先提出人类基因组大规模cDNA测序计划以来，Adams等最先采纳并最早建立了表达序列标记技术，他们随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为。EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的端和端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。由于大多数的长度不足400bp,说明一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST，由于一个基
17、因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆，因此EST既可能对应于一个cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式。,4.3 STS的物理图定位辐射杂种,不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷性细胞,从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的细胞,培养基中添加次黄嘌呤、氨基蝶呤,辐射杂种群,PCR 检测STS标记，根据STS出现频率，判断标记是否连锁及连锁程度,克隆作图,构建全基因组DNA 基因文库,构建指定单一染色体的基因文库,PCR检测STS分子标记,根据重叠STS标记绘制克隆连锁图,提取基因组DNA,流式细胞仪分离染色体,打断 打断,用STS构建Contig,本章主要内容：物理作图法常用物理作图法有那几种常用的指纹分析方法有哪些，它们的分析机理是什么序标位作图如何作图,
