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1、,第七章 蛋白质分离纯化和表征,王顺昌2010.10,第一节 蛋白质的酸碱性质两性电解质，能与酸碱反应，可解离基团主要来自侧链基团解离。P290 sidechain and pKa蛋白质的等电点:与氨基酸比较，大小与所含酸性与碱性氨基酸数目有关。蛋白质的等离子点：在没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出来的质子数目与质子受体结合的质子数相等时的pH isoionic point第二节 蛋白质的分子形状和大小MW6000-1000000一、最低分子量：按化学组成测定：微量元素法，最低aa组成推断法。,二、利用渗透压测定分子量利用半透膜进行测定p292三、蛋白质的扩散和扩散系数扩散：由高浓度向低
2、浓度迁移的现象谓之扩散，扩散的速率可以用扩散系数来描述。1.扩散系数定义：当浓度梯度为一个单位时，在1s内，通过1cm2面积所扩散的溶质量。2.关系：D与蛋白质分子的大小、形状、溶剂的粘度有关。可以用来测定蛋白质分子量,四.蛋白质的沉降分析概念：在超速离心场作用下，蛋白质分子密度大于溶剂密度时，产生沉降，沉降速率与蛋白质分子大小、密度(包装)，溶液的密度、粘度有关。利用超速离心机可以测定蛋白质的分子量，常用方法两种：沉降速率法和沉降平衡法。1.沉降速率法使用超速离心机(40-70w)蛋白质在离心场中，沿旋转中心向外移动，其移动速率代表蛋白质分子的沉降速率。在离心场中，受到三种力，即离心力，浮力
3、和摩擦力。当蛋白质以恒定速率沉降时，Ff=Fc-Fb,沉降系数：在单位离心场内，蛋白质的沉降速率是一个定值，谓之沉降系数，sedimentation coefficient,expressed as s.沉降系数单位s表示，蛋白质、核酸的沉降系数为1x10-13-200 x10-13s范围把10-13谓之一个Svedberg unit,S Hb为4.6x 10-13，即4.6S，在20度下，溶剂为水时的S谓之标准的沉降系数，记为s20.w,偏微分比容，蛋白质0.74cm3/g,其中，v为蛋白质偏微分比容，定义为当加入1g干物质于无限大体积溶液时，体积增加量，ca.0.74cm3/g,2.沉降平
4、衡法在一定的离心力作用下，蛋白质在离心管内形成浓度梯度，通过测定一定梯度内蛋白质的浓度，计算出分子量。式中c1，c2代表离旋转中心x1,x2的蛋白质浓度。其余同Svedberg方程。,五、凝胶过滤法测定分子量六、SDS-PAGE七、蛋白质分子的形状：利用摩擦比，即蛋白质在溶液内的摩擦系数f和理想化的非溶剂化的刚性球体的摩擦系数fG之比，可以描述蛋白质分子形状，f/fG 1.0,则蛋白质为不对称分子或水化分子.,第三节 蛋白质的胶体性质、蛋白质沉淀一、蛋白质的胶体性质：蛋白质分子从尺度上看，是胶体溶液。由于蛋白质分子表面亲水基团可以与水分子产生水化作用，故可在表面形成水化层；表面带电基团可以与水
5、形成稳定的双电层，从而使溶液保持稳定。具有胶体的丁达尔现象，布朗运动、不能透过半透膜等性质。二、蛋白质的沉淀方法如下：盐析脱去水化层导致沉淀，不变性，中性盐;有机溶剂沉淀极性有机溶剂乙醇、丙酮等脱去水化层，降低介电常数，导致沉淀；,重金属盐当pH大于pI时，蛋白质带负电，与重金属结合，形成不溶解的盐沉淀生物碱及某些酸类沉淀单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等，蛋白质在pHpI时，带正电，与酸或生物碱的带负电基团作用。加热：变性沉淀等电点沉淀在等电点时，溶解度最低，因为缺乏了稳定的双电层，同时分子间作用力丧失。,第四节 蛋白质分离纯化一般原则总目标，提高纯度，保持活性，把分离提纯过程分为前处理，粗分级分离
6、，细分级分离一、前处理：破碎和抽提，并把抽提液和细胞碎片分离开。二、粗分级分离：将目标蛋白与细胞其它成分及其它蛋白分离，盐析，等电点沉淀，有机溶剂分级分离，还可以使用超滤、冷冻干燥等方法进行。三、细分离：使用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等，还可以采用各种电泳的方法进行分离。结晶是非常好的方法，但非常困难。就分离纯化方法而言，主要根据蛋白质的分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、与配体分子的生物学亲和力的大小等,第五节 蛋白质分离纯化方法,一、根据分子量大小1.Dialysis and ultrafiltrationDialysis:this method can separate a
7、 solution of protein from a bathing solution by a semipermeable membrane,in which small molecules and ions can pass through the membrane to equilibrate between the protein solution and the bathing solution.与无机盐、单糖等小分子物质分开，不能将不同蛋白质分开。,Ultrafiltration：is an improved dialysis protocol,where particular
8、size range of molecules can pass through sized pore membrane under pressure.2.密度梯度离心：在一个离心管内，先使用梯度混合器形成蔗糖密度梯度，加入蛋白质，在离心时，一定分子量的蛋白质停留在特定的密度梯度内，可以分步收集。p302,3.凝胶过滤：Other names include gel filtration chromatography or molecular sieve chromatography.,Fine,porous beads composed of dextan polymers such as
9、Sephadex,agarose such as Sepharose,or polyacrylamide such as Sephacryl or BioGel P,are packed into a chromatography column.The pore sizes of the beads approximate the dimensions of the macromolecules.,p303,The total bed volume is Vt,the volume outside the porous beads is Vo,and the volume inside the
10、 beads is Vi,the volume actually occupied by the beads material is Vg(typically less than 1%of Vt,and thus can be ignored,then:Vt=Vo+Vi+Vg=Vo+ViWhen protein mixtures pass through the column,the protein molecules passively distribute between Vo and Vi,depending their sizes.The sizes of the molecules
11、larger than the pores sizes of the beads will not enter the beads and thus washed first(elute).The elution volume Ve is equal to Vo.,If a particular molecule can enter the pores of the beads,its distribution is given by the distribution coefficient,KD:KD=(Ve-Vo)/Vi,where Ve is specific for a particu
12、lar molecule in particular solution system,二、利用溶解度1、等电点沉淀：pH=pI，不带电，分之间静电排斥力没有，倾向于彼此聚集。由于不同蛋白质具有不同的等电点，故可以分离蛋白质p305,Figure102、盐析和盐溶在一定的浓度范围内，中性盐可以增加蛋白质溶解度的现象谓之盐溶(salting in).Figure10,11随着离子强度升高到一定数值时，蛋白质开始下降并逐渐从溶液中沉淀出来的现象谓之盐析。,饱和或半饱和硫酸铵,3、有机溶剂分离4、温度对蛋白质溶解度的影响：多数蛋白在0-40C时，溶解度与温度成正比，但Hb在0-25C，溶解度随温度升高
13、而降低。40-50C，蛋白质变得不稳定。三、根据电荷不同分离1.电泳：在外电场作用下，蛋白质分子向与其电性相反方向移动的现象。this technique is based on the movement of ions in an electrical field.In solution,the velocity of the charged molecule is proportional to its charge q and the voltage E,but inversely proportional to the viscosity of the medium y and d,t
14、he distance between the electrodes.,最简单的是区带电泳，根据支持物不同分为纸电泳和薄膜电泳；粉末如淀粉、硅胶电泳；细丝电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳装置：电源，电泳槽,The electrophoresis is performed in a porous support matrix such as polyacrylamide or agrose.The main methods include SDS-PAGE,isoelectric focusing and two-dimensional gel electrophoresis.(1)PAGE使用聚
15、丙烯酰胺凝胶作为支持物，圆盘、平板三个效应：浓缩效应（浓缩胶）、分子筛效应、电荷效应。蛋白质显色：氨基黑，考马斯亮蓝等,(2)SDS-PAGE:SDS is sodium dodecylsulfate,it has a hydropoobic tail that strongly react with polypeptide chains.The number of SDS molecules bound by a polypeptide is proportional to the length of the polypeptide.About 1 molecule SDS binds 2
16、AA residues.The 2 negative charges of each SDS molecule overwhelm the intrinsic charge the protein might have,and thus disrupts the tertiary structure of a protein.,Under such conditions,the mobility of a protein is inversely proportional to the logarithm of the proteins MW,and can be used to determ
17、ine the MW of a protein.Mass-charge ratio of different protein are almost the same,so the mobility is only determined by it MW,ie,the smaller MW,the faster the velocity.,(3)Isoelectric focusing:The ampholytes is first electrophosered through a gel to form a pH gradient in the tube,the protein mixtur
18、e is applied to the gel and resume electrophoresis.The proteins will migrate and stop to the position corresponding to its repective pIs.,(4)2-D gel electrophoresisThe protein mixture subjecting to isoelectric focusing first,and then the gel is removed and laid along the top of an SDS-PAGE slab,the
19、proteins are electrophoresed into the SDS PAGE,where they separated according to size.The individual protein can be stained and identified,2.离子交换层析：根据蛋白质所带电荷的不同，与离子交换柱的吸附能力也不同，通过改变洗脱液的pH和离子强度，从而影响蛋白质和交换柱结合程度，结合程度小的先被洗脱。离子交换剂:cation exchang media-negative charged,Anion exchange media-positived charge
20、d,洗脱方式：溶液不变改变洗脱液的盐度和离子强度：其一采用梯度分段式改变的分段洗脱(stepwise)；其二采用渐进式连续改变盐度或pH,谓之gradient elution，可以采用专门的梯度混合器。,Positive charged proteins added,四、选择性吸附利用一些吸附剂进行吸附，其主要作用力是范德华力和氢键，如使用羟基磷灰石，活性炭、氧化铝等。通常选择的洗脱液的极性与混合物中极性最大的组分相当。1.羟基磷灰石：为结晶磷酸钙，蛋白质中负电基团与吸附剂中钙结合，对双链DNA亲和力大，洗脱液往往是磷酸缓冲液，增加缓冲液浓度，可以把不同的蛋白组分分开，也可以用于单双链DNA的
21、分离。,2、疏水作用层析：吸附剂上的疏水基团与蛋白质表面疏水基团作用，从而达到吸附的目的。一般把pH调节在pI附近，并且在硫酸铵存在下，暴露表面疏水基团，通常使用降低离子强度，增加pH，并且使用triton-X100,脂肪醇等置换剂。五、亲和层析利用蛋白质分子对配体的特有结合能力，将目标蛋白从复杂的蛋白质混合物中分离出来。纯度高，目前广泛用于核酸，核苷酸，IG，受体，酶等纯化。,配体：把配体与琼脂糖凝胶共价连接，通常在配体和凝胶之间加一个e-氨基己酸，当蛋白质通过层析柱时，目标蛋白与配体结合被吸附，其它非特异性吸附的蛋白通过洗脱液洗去，再使用含相应的特异性配体的洗脱液洗脱目标蛋白。如凝集素亲和层析，免疫亲和层析和金属螯合亲和层析等。,第六节 蛋白质含量测定和纯度分析一、含量测定凯氏定氮法，双缩脲法，Folin-酚法(Lowry法)，紫外吸收法，染料结合法(Bradford)二、纯度鉴定电泳、沉降、HPLC等，还可以使用N-末端分析等。,&,
