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1、蛋白质含量测定法,考马斯亮兰法（Bradford法）,实验原理考马斯亮蓝G-250染料+碱性芳香族氨基酸在磷酸的作用下，最大吸收为595nm(兰色）,器材与试剂,722型和753型可见光分光光度计漩涡混合器试管16支标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.03mg/ml和0.103mg/ml。考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。,实验方法,标准方法取10支试管，分别编号后按 表1-1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。加
2、完染料20min后，使用722分光光度计（灵敏度4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595，查表即可求得未知样品的蛋白质含量。,微量法取10支试管，分别编号后按 表1-3 剂量依次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。其他步骤同上，不过使用753分光光度计（狭缝4）。,SDS干扰实验取5支试管，分别编号后按表1-5剂量依次加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。加完染料20min后，使用753分光光度计
3、（狭缝4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。,实验数据与结果分析,标准方法的数据和图,表1 考马斯亮兰标准法实验表格,根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（g）为横坐标，作图1。,图1 考马斯亮兰标准法,图1 考马斯亮兰标准法,微量法的数据和图,表2 考马斯亮兰微量法实验表格管号标准蛋白质（0.103mg/ml）未知蛋白质（约0.5mg/ml）蒸馏水考马斯亮兰G-250试剂对应的吸光度根据表2，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（g）为横坐标，作图2。,图2 考马斯亮兰微量法,SDS干扰数据和图,表3 考马斯亮兰SDS干扰实验表格管号123456标准蛋白质（1.03mg/
4、ml）蒸馏水考马斯亮兰G-250试剂对应的吸光度根据表3，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图3。,图3 考马斯亮兰SDS干扰实验,由上图可以看出，十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮兰法测蛋白质含量有干扰，同是0.103mg/ml的标准蛋白与3.0ml考马斯亮兰，但随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。,紫外吸收法,实验原理280nm的光吸收法：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处有最大吸收。215nm与225nm的吸收差法：蛋白质因为含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差
5、，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。肽键测定法：蛋白质溶液在238处的光吸收强弱，与肽键的多少成正比。可以测238nm处吸收值，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。,器材与试剂,（一）器材1SPECORD200分光光度计2漩涡混合器3试管12支（二）试剂标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.03mg/ml。,实验数据与结果分析,（一）紫外280nm吸收法数据和图表4 紫外280nm光吸收法管号123456BSA(1.03mg/ml)体积浓度（mg/ml）,根据表4，以A280为纵坐标，SBA浓度为横坐标，作图4。,图4 紫外280nm光吸收法,根据直线拟和方程y=0.6105x+0.0132求解当标准蛋白（牛血清清蛋白）与文献值6.3比较接近。,紫外215nm与225nm的吸收差法的数据和图表5 紫外215nm与225nm的吸收差法管号123456未知BSA(1.03mg/ml)体积浓度吸收差根据表5，以吸收差为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，作图5。,图5 215nm与225nm吸收差法,肽键测定法,表6 肽键吸收法管号123456未知BSA(1.03mg/ml)体积浓度 根据表6，以A238为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，作图4。,图6 肽键测定法,
