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1、蛋白质的结构与功能,第 一 章,Structure and Function of Protein,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,二、蛋白质的生物学重要性,1.蛋白质是生物 体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,2.蛋白质具有重要的生物学功能,3.氧化供能,1.催化功能-酶2.调节功能-激素、基因调控因子3.转运功能-膜转运蛋白、
2、血红/血清蛋白4.贮存功能-乳、蛋、谷蛋白5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白6.结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架7.支架作用-接头蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.异常功能,蛋 白 质 的 分 子 组 成The Molecular Component of Protein,第 一 节,组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克
3、数 6.25100,1/16%,蛋白质元素组成的特点,一、氨基酸 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,手性化合物是指分子量、分子结构相同，但左右排列相反，如实物与其镜中的映体。,Levorotatory,Dextorotatory,-C-C-C-C-COOH-C-C-C-C(NH2)-COOH-氨基酸-C-C-C(NH2)-C-COOH-氨基酸-C-C(NH2)-C-C-COOH-氨基酸,什么是-氨基酸？,非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,（一）氨基酸的分类,*20种氨基酸的英文名称
4、、缩写符号及分类如下:,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性疏水性氨基酸,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methio
5、nine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,2.极性中性氨基酸,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,3.酸性氨基酸,4.碱性氨基酸,几种特殊氨基酸,脯氨酸（亚氨基酸）,半胱氨酸,胱氨酸,（二）氨基酸的理化性质,1.两性解离及等电点
6、,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点(isoelectric point,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,2.紫外吸收,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,3.茚三酮反应,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于
7、此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。,二、肽,*肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）肽(peptide),+,甘氨酰甘氨酸,肽键,*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端C 末端：多肽链中有
8、自由羧基的一端,多肽链有两端,*多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二）几种生物活性肽,1.谷胱甘肽(glutathione,GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故常简写为G-SH），易与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属）等结合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强
9、免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。,谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重要的作用。在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量很高，达1001000mg/100g，在人体血液中含2634mg/100g，鸡血中含5873mg/100g，猪血中含1015mg/100g，在西红柿、菠萝、黄瓜中含量也较高（1233mg/100g），而在甘薯、绿豆芽、洋葱、香菇中含量较低（0.060.7mg/100g）。,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2.多肽类激素及神经肽,蛋 白 质 的 分 子 结 构The Molecular Structure of Protein,第 二
10、节,蛋白质的分子结构包括 一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure),定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,一、蛋白质的一级结构,主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,胰岛素的一级结构及不同动物胰岛素在A链中的差异,肽键,-C-C-C-C-COOH,肽键和肽单元,肽单元,两个肽单元,肽键中的4个原子及相邻的2个-C原子重复形成的长链结构,-C-C-C-C-COOH,肽键中C-
11、N键有部分双键性质 不能自由旋转组成肽键原子处于同一平面（肽平面）键长及键角一定大多数情况以反式结构存在,化学中的顺式与反式,2-丁烯 CH3CH=CHCH3,顺反异构体,顺-2-丁烯,反-2-丁烯,定义,顺反异构是构型异构的一种形式双键碳原子上所连的原子或基团中两个相同者的位置来决定异构体的类型。同侧：顺式异构(cis-isomerism)异侧：反式异构(trans-isomerism),顺反异构体的不同点,沸点：4,沸点：1,燃烧热：2536KJ/mol,燃烧热：2532KJ/mol,极性不同,稳定性不同,几个顺反异构的典型例子,人工合成的雌激素物质由于羟基距离的不同，反式已烯雌酚的活性强
12、于顺式已烯雌酚,顺-己烯雌酚,反-己烯雌酚,雌二醇,马来酸有毒，富马酸无毒都是化工原料，但富马酸有一定的医药作用,马来酸,富马酸,顺铂可抑制癌细胞的DNA复制过程，有较强的广谱抗癌作用。临床用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌等多种癌症治疗反铂不仅不能治疗癌症,肾毒性也比顺铂大.,二、蛋白质的二级结构,主要的化学键：氢键,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-转角(-turn)无规卷曲(random coil),（二）-螺旋,螺距0.54nm每圈含3.6个AA残基 每个AA残基占0.15nm 绕轴旋转100链内形成氢键与轴平行多为右手螺旋
13、,具有7个跨膜肽段的膜蛋白多肽链来回跨膜折叠7个螺旋段反平行装配 如细菌紫膜质,胞外结构域,大纤维,鳞状细胞,皮层细胞,微纤维,微原纤维,初原纤维,螺旋,（三）-折叠,由两/多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成。肽链主链呈锯齿状折叠构象。,桶型膜蛋白膜孔蛋白以大折叠片形式横跨膜 如膜孔蛋白,（四）-转角和无规卷曲,-转角,肽链主链骨架180的回折结构特点：由4个连续的AA残基组成第一个残基C=O第四个残基NH,泛指不能归入明确的二级结构如折叠片和螺旋的多肽片断。,无规卷曲（random coil）,富含金属或二硫键（小的不规则）蛋白质,铁氧还原蛋白,（五）模体,在许多蛋白质
14、分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,一段肽链有多个酸性氨基酸残基相邻，则在pH7.0时这些残基的游离羧基都带负电荷，彼此相斥，妨碍-螺旋的形成。同样，多个碱性氨基酸残基在一肽段内，由于正电荷相斥，也妨碍-螺旋的形成。,天冬酰胺、亮氨酸的侧链很大，也会影响-螺旋形成。,脯氨酸的结构不利于形成-螺旋。,形成-折叠的肽段要求氨基
15、酸残基的侧链较小，才能容许两条肽段彼此靠近。,三、蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,（一）定义,肌红蛋白(Mb),纤连蛋白分子的结构域,（二）结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。,型胶原酶的结构域动态图,（三）分子伴侣,分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。,分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。分子伴侣也可与错误聚集的肽段结
16、合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,四、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。,血红蛋白的四级结构,血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构。Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似。Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。,血红蛋白的一、二、三、四级结构,五、蛋白质的分类,（1）、依据外形分类球状蛋白质：globular protein 纤维状蛋白质：fibr
17、ous protein 膜蛋白质：membrane protein,简单蛋白 simple protein 单纯蛋白，仅由氨基酸组成结合蛋白 conjugated protein,由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成,（2）、依据蛋白质的组成分类,简单蛋白,清蛋白和球蛋白 albumin and globulin 广泛存在于动物组织谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelin and prolamin 植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱精蛋白和组蛋白 碱性蛋白存在于细胞核硬蛋白,结合蛋白,色蛋白：简单蛋白+色素物质糖蛋白：简单蛋白+糖类物质脂蛋白：简单蛋白+脂类结合核蛋白：简单蛋白+核酸,蛋白质结构与功
18、能的关系The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能,一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。,氨基酸残基序号 胰岛素 A5 A6 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 猪 Thr Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔 Thr Gly Ile Ser 牛 Ala Gly Val A
19、la 羊 Ala Ser Val Ala 马 Thr Ser Ile Ala,促肾上腺皮质激素(ACTH)和促黑激素(-MSH,-MSH)共有一段相同的氨基酸序列，因此，ACTH也可促进皮下黑色素生成但作用较弱。,(三)氨基酸序列提供重要的生物化学信息,一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素c(cytochrome c)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。,从细胞色素c的一级结构看生物进化 物种进化过程中越接近的生物，细胞色素的一级结构越相似,（四）一级结构与功能的关系,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,缬,镰刀状贫血病血液中大量出现
20、镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息,正常细胞 镰刀形细胞,它是最早认识的一种分子病死亡率极高由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构突变,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构,二、蛋白质空间结构与功能的关系,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,氧饱和度,氧分压,(R)relaxed state,(T)tense state,血中氧分子的运送,静脉,动脉,环境氧高时Hb 快速吸收氧分子,环境氧低时Hb 迅速释放氧分子,释放氧分子后Hb 变回
21、 T state,T state,R state,*协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity),血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,变构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发
22、生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,正常的Prion蛋白含有大量的螺旋,病变的Prion蛋
23、白含有更多的折叠,第四节,蛋白质的理化性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein,（一）蛋白质的两性电离,一、理化性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,*蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分
24、子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜,胶体是一种均匀混合物,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻
25、，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,*蛋白质的凝固作用(protein coagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,（四）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其
26、浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,（五）蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,二、蛋白质的分离和纯化,（一）透析及超滤法,*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,*超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,血液透析,小分子被带出,透析机,透析液,加压,血液
27、,（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,盐析,向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？,*免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,（三）电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗
28、粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,等电聚焦电泳,等电聚焦电泳,双向电泳,双向凝胶电泳,（四）层析,层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力
29、等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。*凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,离子交换层析,凝胶过滤,（五）超速离心,*超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient,S)表示,即颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。,三、多肽链中氨基酸
30、序列分析,Edman降解，主要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。首先使用苯异硫氰酸酯(PITC)对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断。,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,四、蛋白质空间结构测定,*二级结构测定通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的
31、负峰和198 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。,*三级结构测定X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,衍射图片,电子密度,三维结构,phi,相角求解,X射线衍射实验和结构计算过程,*用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。,根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构,*通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。,蛋白质结构预测过程,150,ORF翻译,实验数据,151,PredictProtein分析结果,应用：药物设计中的蛋白质-配体对接,将对接算法应用于虚拟筛选，从小分子库中寻找潜在的配体分子。这样的分子可作为药物的先导物。,要点,氨基酸 L-三字符号分类等电点测定基础,蛋白质 肽键、寡肽、多肽四层次结构模体、结构域结构与功能的关系等电点测定基础分离纯化,
