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1、血清球蛋白的分离、纯化及鉴定,分工合作,专人、固定锥形瓶，放开，不断滴加pH6.3醋酸盐缓冲液，防止气泡。盐析混匀时需要两个人合作。两次操作是一样的，都有动手的机会。改错！（P46页错误）,操作,一、盐析 取1ml血清1ml，取1ml饱和(NH)SO溶液缓慢滴入，边加边摇。混匀后于室温中放置10分钟。,目的要求,(一)掌握分离纯化蛋白质的基本原理。(二)了解柱层析技术。,实验原理,蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条件下，带电的情况等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。,一、粗提（盐析法）,盐析的定义。常用的中性盐有
2、：硫酸铵、硫酸钠等，由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。因此，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。,血清中含有清蛋白和球蛋白。用半饱和的(NH)SO盐析可使球蛋白沉淀，而清蛋白仍留在溶液中，经离心而分离。原因：一、清蛋白等电点是4.0。2球蛋白等电点是5.06，球蛋白等电点是5.1，球蛋白等电点是7.1。二、清蛋白的分子量远小于球蛋白,二、脱盐（凝胶层析法）,盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。,凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层
3、析柱时，各分子的扩散移动速度不同，使混合物质得到分离的技术。凝胶有多种，葡聚糖凝胶是最常用的一种人工合成凝胶。,混合物中各种物质同时进行着两种不同的运动，垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质(蛋白质)直径大不能入凝胶颗粒的网孔，垂直向下的速度较快。小分子物质(无机盐)可扩散入凝胶颗粒网孔之中，结果小分子物质流出所经的路程较大分子为长，从而使混合物中各组分按分子大小不同的顺序流出，得到除去盐的蛋白质溶液。,三、纯化（离子交换法）,离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称阳离子交换剂。DEAE纤维素是一种阴离子交换剂。,
4、因球蛋白中及球蛋白的pI6.3 而球蛋白的pI6.3(pI7.3)故经DEAE纤维素阴离子交换层析流出的第一部分蛋白质为纯化的球蛋白。纯化前后的球蛋白用电泳法进行鉴定。,操作,一、盐析 取1ml血清1ml，取1ml饱和(NH)SO溶液缓慢滴入，边加边摇。混匀后于室温中放置10分钟。,然后每分3500转离心10分钟，并小心吸去上清液，用滤纸条吸除上清夜。沉淀加pH6.5醋酸氨缓冲液0.5ml，使之溶解，作为纯化球蛋白用。,二、G25凝胶层析脱盐,（一）葡聚糖凝胶G25层析柱的制备：1、取层析柱，关紧下端出口加蒸馏水少许。2、缓慢加入膨胀处理过的凝胶悬液，预先经pH6.5醋酸盐缓冲液流洗平衡。,3
5、、待胶下沉至1015cm高(防止凝胶分层和柱内混有气泡，使表面整平并盖一滤纸片，即可使用。,（二）上样与洗脱：,1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床)。2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整)。,3、开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出口，小心加入适量pH6.3磷酸缓冲液。4、放开，流速约20滴/分钟，立即检测（方法见后），检测到蛋白后收集三管，20滴/管。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。,洗脱液中蛋白质的检查,取小试管3个，分别加20磺基
6、水杨酸10滴，从下端管口取1滴，滴于试管中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出。对比法：与未加液体的管对比，出现浑浊即开始收集。,三、阴离子交换层析,经处理再生后的DEAE纤维素，将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱，分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，20滴/管，编号。,五、注意事项,1、盐析：边加边混（为什么？）。2、滴速：20滴/分。3、避免污染磺基水杨酸。,下午,浓缩,刷一个干净的小试管，滤纸上控干。找一张干净的纸条，折叠，倒入一包葡聚糖干粉，小心的送入试管底部。加入1号管的样品，小心的震荡混匀，取上层液体一滴上样。,如果液体太少，小心的滴加2号试管的液体，混匀，取上清夜点样。回收！,四、醋酸纤维素薄膜电泳检查,样品：(1)血清。(2)纯化的球蛋白液(由于此溶液浓度较低，应多次点样于同一位置（10次），每次点样时待干后再点。,注意事项,1、不要调电泳仪！2、血清接触过的点样器、玻片用完后抛入84消毒液30分钟后清洗3、多次点样在同一位置！,1、所用缓冲液为醋酸铵缓冲液，还是硫酸铵？2、完全饱和的硫酸铵中清蛋白、球蛋白是否均发生沉淀？3、层析的原理是什么？,思考题,再生,醋酸根离子Cl离子蛋白质离子,
