《工业微生物代谢调控育种.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《工业微生物代谢调控育种.ppt（50页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第七章 工业微生物代谢控制育种,第一节 概论第二节 初级代谢调控第三节 次级代谢调控 第四节 代谢调节控制育种,第一节 概论,以生物化学和遗传学为基础。研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株从而人为地使有用产物选择性地大量合成和累积。代谢控制发酵的关键，取决于微生物代谢调控机制是否能够被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为控制微生物的代谢。,一、初级代谢产物和初级代谢 初级代谢产物又可分为中间产物和终产物，但这种定义往往是相对的.二、次级代谢产物和次级代谢 这些物质有抗生素、生长刺激素、生物碱、色素、毒素以
2、及甾体等。通常把以初级代谢产物为前体，合成次生产物的代谢体系称为次级代谢。,三、初级代谢与次级代谢的关系 在生化代谢途径、酶系关系以及调控上，次级代谢与初级代谢都有着密切关系。从遗传代谢观点看，初级代谢与次级代谢同样受到核内DNA的调节控制。所不同的是，次级代谢产物还受到与初级代谢产物生物合成无关的遗传物质控制即受到核内遗传物质和核外遗传物质（质粒）的控制。因此，两者在遗传控制上，既有相同的部分，也有不同的部分。,代谢调节控制育种:通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。,第二节 初级代谢的调节控制,
3、它包括两个方面，一是调节酶的合成量，二是调节现成酶分子的催化活力（反馈抑制）。一、酶合成的调节（一）酶合成调节的类型 1诱导 酶划分成组成酶和诱导酶两类。2阻遏 阻遏的类型主要：末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种。（二）酶合成调节的机制 提出的操纵子便说可能较好地解释酶合成的诱导和阻遏现象。,乳糖代谢基因表达调控图解：(没有乳糖时),lacZ,lacY,lacA,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因,RNA聚合酶,信使RNA,转录,翻译,阻抑物与操纵基因结合，结构基因转录受阻,阻抑物,乳糖代谢基因表达调控图解：(有乳糖时),lacZ,lacY,lacA,调节基因,启动子,操纵基因,结构基因
4、,RNA聚合酶,信使RNA,转录,翻译,阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与操纵基因结合，使得结构基因进行转录。,阻抑物,乳糖,转录,半乳糖苷酶,酶,酶,乳糖分解代谢调控过程是一个自我调控过程,二、酶活性的调节（一）反馈抑制的类型1直线式代谢途径中的反馈抑制2分支代谢途径中的反馈抑制 优先合成：分支途径中一个终产物优先被合成，浓度过量后，抑制自身合成途径，使代谢转向合成另一个终产物、例如黄色通杆菌优先合成谷氨酸，当谷氨酸过量后，使代谢转向合成天冬氨酸。协同反馈抑制 合作反馈抑制 积累反馈抑制 同工酶调节：顺序反馈抑制（二）反馈抑制的机制,三、反馈抑制和反馈阻遏的比较,第三节 次级代谢的
5、调节控制,初级代谢和次级代谢都受到菌体代谢调节，由于它的代谢途径是相互交错的，所以在调节控制是相互影晌的。例:抗生素的生物合成途径中反馈调节作用包括：一方面，抗生素本身积累就能起反馈调节作用，另一方面，初级代谢产物作为抗生素合成的前体，当其受到反馈调节时，必然会影响抗生素的合成。,一、次级代谢产物的诱导调解 两种方式进行：(1)诱导物刺激影响初级代谢造成代谢流的改变大量生成次生代谢物；(2)诱导物次生代谢物合成酶的合成大量生产次生代谢物。例如色氨酸对麦角碱的作用如蛋氨酸能提高头孢霉素C的产量的诱导剂,二、次级代谢产物碳源分解调节 20世纪40年代初期就发现，青霉素发酵过程中，虽然葡萄糖被菌体利
6、用最快，但对青霉素合成并不适宜。而乳糖利用虽然较慢，却能提高青霉素产量。不同的碳源对次级代谢产物积累的作用是不一样的,一般认为速效碳源都比较差.例:积累头孢菌素c抗生素比产率递减顺序为蔗糖半乳糖果糖麦芽糖葡萄糖,三、次级代谢产物氮源分解调节 氮源分解调节是类似于碳源分解一类的分解阻遏方式。它主要指含氮底物的酶（如蛋白酶。硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸酶和脲酶）的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。在次级代谢中。氮分解代谢产物阻遏作用是确实存在的。例:阿维菌素的产生,四、次级代谢反馈调节（一）次级代谢自身产物的反馈调节 抑制特定产生菌合成抗生素所需浓度与生产水平具有相关性，一般产生菌产量高，对自身
7、抗生素的耐受力强，反之则超敏感。,（二）分支代谢中初级代谢物的反馈调节对次级代谢的影响 第一方式：次级途径和初级途径具育共同的分叉中间体，由分叉中间体产生的初级代谢终产物的反馈调节可能影响次级代谢产物的形成。第二种方式：在抗生素生物合成途径中，初级代的终产物作为前体合成次生产物。由于这些终产物受初级代谢反馈调节，而也必然影响到后面的抗生素的合成，外源前体也将导致反馈调节。,五、磷酸盐的调节 磷酸盐不但是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节抗生素生物合成的重要因子。已发现过量磷酸盐对四环类、氨基糖苷类和多烯大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。所以，在工业生产中，磷酸盐常常被控制在适
8、合菌体生长的浓度以下，即所谓的亚适量。,磷酸盐浓度高低还能调节发酵合成期出现的早晚，磷酸盐接近耗尽后，才开始进人合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。例:金霉素、万古霉素等的发酵都有此现象。磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的菌体。,六、细胞膜透性的调节 微生物的细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高度选择性。细胞内合成代谢的产物不能分泌到胞外，必然会产生反馈调节作用，影响发酵产物的生产量，另一方面的可能是细胞外的营养物质不能进人细胞内，从而影响产物的合成造成产量下降。因此，细胞膜的通透性是代谢调节的一个重要方面。,第四节 代谢调节控制育种,
9、一、组成型突变株的选育 组成型突变株:是指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型,筛选方法及实例:1限量诱导物恒化培养 将野生型的菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养。由于该培养基中底物浓度低到对野生型菌株不发生诱导作用，所以诱导型的野生型菌株不能生长，而突变株由于不经诱导就可以产生诱导酶而利用底物，因而很快得以生长成为组成型菌株。培养过程正确控制培养时间，使组成型突变株得以繁殖，而诱导型菌株则被淘汰。例如在低浓度乳糖恒化器内连续培养大肠杆菌，其中组成型突变株不要加诱导物也能合成半乳糖苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为能
10、源和代谢原料，迅速得以生长，但野生型菌株因缺少诱导物和相应的酶，不能利用乳糖而淘汰。,2、循环培养 要解除诱导的菌株，移接到含有诱导物和不含诱导物的培养基上交替连续循环培养。由于组成型突变株在两个培养基上都能产酶，生长逐渐占优势。将此培养物移到含诱导物培养基中培养，此时组成型菌株立即开始生长，而诱导型野生菌株须经一段停止时间才开始生长，只要细心控制在含诱导物培养基中培养时间，反复交替培养，组成型逐渐占优势，诱导型却被淘汰。,3、鉴别性培养基的利用 如将诱变孢子悬液涂布在甘油作唯一碳源的平板上；培养后长出菌落。然后在菌落上喷上对硝基苯酚-D半乳糖苷（ONPG），组成型成黄色，诱导型呈白色。这是由
11、于组成突变株在没有诱导底物存在时仍能产生半乳糖苷酶，将无色试剂水解，放出O-硝基苯酚，因而很容易挑选。此方法为目测法，可免去上述几种方法的浓缩富集过程。,4筛选 经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。,二、抗分解调节突变株的选育 抗分解调节突变就是指抗分解阻遏和抗分解抑制的突变。在实际生产中，最常见的是碳源分解调节、氮源分解调节和磷酸盐分解调节（尤其在次级代谢）。例如以甘油和铵盐培养产气杆菌时，能产生组氨酸，当采用葡萄糖代替甘油作碳源，则酶的合成受抑制；易迅速利用的碳源对次级代谢的影响也很大，特别对抗生素。,（一）解
12、除碳源调节突变株的选育 筛选方法与实例：1循环培养法 将诱变剂处理后的微生物移接到快速利用的碳源和慢速利用的碳源培养基上进行交替培养，然后筛选需要的突变株。,2鉴别性培养基3特殊氮源 用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为唯一氮源配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌，可以选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。由于野生型菌株合成组氨酸酶被葡萄糖阻遏，而突变株则可产生组氨酸酶，能迅速生长形成菌落。,4葡萄糖结构类似物（2-Dg,3-Mg）（1）筛选方法（2）抗性突变株的性质,（二）解除氮源分解调节突变株的选育 氮源分解调节主要指含氮底物的分解酶受快速利用的氮源阻遏。细菌、酵母、霉菌等微生物对初级代谢产
13、物的氮降解物具有调节作用。次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株是提高蛋白酶产量的一种有效方法。因为高浓度氨基酸会抑制芽胞的形成，并也阻遏蛋白酶的合成。据试验若从高浓度葡萄糖培养基中筛选高产蛋白酶芽孢杆菌，也能得到同样效果。,（三）解除磷酸盐调节突变株的选育 磷酸盐在许多抗生素、核苷酸的发酵中，是初级代谢中菌体生长的主要制约因子，又是不可缺少的营养成分，但是磷酸盐过量在合成某些产物时是不利的，特别是抗生素的合成。,1、磷酸盐对次生产物的调节机制 通过调节初级代谢的变化影响次级代谢 通过对ATP的调节来控制抗生素的基因表
14、达2、抗磷酸盐突变株的筛选方法 Martin建立了一种直观的筛选磷酸盐抑制脱敏突变体的方法，磷酸盐敏感菌只产生很小的抑菌圈，耐脱敏突变体的抑菌圈则显者增大。,三、营养缺陷型在代谢调节育种中的应用 在营养缺陷型菌株中，由于生物合成途径中某一步发生障碍，合成反应不能完成，从而解除了终产物反馈阻抑。外加限量需要的营养物质，克服生长的障碍，使终产物不致于积累到引起反馈调节的浓度。从而有利于中间产物或另一途径的某种终产物的积累。,（一）在初级代谢调节育种中的应用1.在直线式生物合成途径中 营养缺陷型突变株不能积累终产物，只能累积中间产物。,谷氨酸,N-乙酰谷氨酸,N-乙酰-谷氨酰磷酸,N-乙酰谷氨酸半醛
15、,N-2-乙酰鸟氨酸,鸟氨酸,瓜氨酸,精氨酰琥珀酸,精氨酸,2.在分支式生物合成途径中 营养缺陷型突变导致协同反馈调节某一分支途径的代谢阻断，使这一分支途经的终产物不能合成。,葡萄糖,乙酰辅酶A,柠檬酸,-酮戊二酸,L-谷氨酸,生物素,脂肪酸,硫胺素,（二）在次级代谢调节育种中的应用 在初级代谢产物和次级代谢产物的分支代谢途径中，营养缺陷型切断初级代谢支路有可能使抗生素增产。据报道，四环素、制霉菌素产生菌的脂肪酸缺陷型可增加抗生素的产量。有的营养缺陷型菌株还可以产生新产品、例如去甲基金霉素，该抗菌素毒性低，药效长。营养缺陷型除直接应用于工业发酵生产外，还给遗传研究提供标记菌株，微生物遗传研究和
16、代谢机制与调节研究不可缺少的工具。,四、渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用 渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。获得渗漏型的方法是把大量营养缺陷型菌株接种在基本培养基平板上，挑选生长特别慢而菌落小的即可。可以利用渗漏缺陷型既能少量地合成代谢终产物，又不造成反馈抑制的现象，筛选抗反馈调节突变株，其原理类似于营养缺陷型只是不必添加限量的缺陷营养物。,五、抗反馈调节实变株的选育 抗反馈调节突变株:是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产，如果由于结构基因突变
17、而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，即是失去了反馈抑制的突变，称为“抗反馈突变型”，若是由于调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢产物相结合而失去阻遏作用的，称为“抗阻遏突变型”。操纵基因突变也能造成抗阻遏作用。产生类似于组成型突变的观象。,筛选抗反馈调节突变株可以通过以下途径：（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株 1回复突变的原因（1）原有基因的回复突变（2）非原有基因回复突变,2回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选（1）初级代谢途径障碍性回复突变型“原养型营缺型原养型”反馈调节变构酶的调节中心发生突变造成 由芽孢杆菌产生的蛋白酶，首先选取低产菌株获得一部分嘧啶和嘌呤缺陷型，再进一步筛选得到
18、回复突变型菌株，使蛋白酶产量提高5-10倍。,（2）次级代谢途径障碍性回复突变型“零变株”是完全失去产生抗生素的能力可是它们的回复突变株的产量往往比亲株高。次级代谢回复突变，是一种初级代谢途径或次级代谢途径障碍性回复突变型。零变株的回复突变株的筛选：抗生素菌株,以上数例有一个共同趋向，即发生障碍性突变的营养缺陷型，抗生素产量大多数都比亲株低而回复突变株往往比原养型亲株高。产生这种现象的原因：主要是以上缺陷型菌株由几种不能合成的氨基酸都是参与相应抗生素生物合成的。比如甲硫氨酸是金霉素合成的甲基供体，亮氢酸是合成放线菌素的原料。基因突变结果，使菌体丧失参与合成这些氨基酸的某种酶的活力，导致有关抗生
19、素合成过程因缺乏这些氨基酸而产量下降。,（二）耐自身产物突变株选育 一个菌株的生产能力与耐自身抗生素的浓度是成正相关的。除耐自身产物之外，还可以考虑与以下情况结合进行：第一、抗Mg离子突变；第二，许多抗生素的钝化酶已知作为选择性标记，设想筛选高活性钝化酶的变株，,（三）抗终产物结构类似物突变株的选育 1直线合成途径 利用抗结构类似物的方法，可以直接累积终产物。2分支途径,（四）累积前体和耐前体突变株的选育 用一系列平皿，做成梯度浓度，用于涂皿培养、此法浓度跨度大，有一定价值。前体物对抗生素生物合成的产量影响：其一作为组成成分掺人生物合成，其二导致反馈调节。1耐“毒牲”前体突变株的选育2耐前体结
20、构类似物突变株的选育3耐前体的有关代谢物突变株的筛送,六、细胞膜透性突变株的选育1.营养缺陷回复变株的选育可改变细胞膜透性生物素缺陷型的突变株、油酸缺陷型的突变株、甘油缺陷型的突变株2.温度敏感突变株的选育3.溶菌酶敏感突株的选育,七、其他抗牲突变株的选育 芽孢杆菌属的许多种类是重要的酶制剂生产菌。根据有关学者观察和动力学分析，产酶高峰和芽孢的形成有一定的关系。一般培养到一定阶段后就会产生芽孢，芽孢数量达到高峰，就停止产酶故如能延迟或不产生芽孢，酶的产量便可提高。如蜡状芽孢杆菌产淀粉酶菌株，菌种选育时发现在抗利福平的突变型中往往有较多的无孢子突变株，把该菌用诱变剂处理，涂布在含利福平的干板培养
21、基上，长出的菌落薄而透明（无芽孢突变型的特怔），镜捡或使用产生芽孢的培养基进行验证，结果得到的是无芽孢突变型。淀粉酶产量以7倍高于亲株。这也是一个药物抗性突变型应用的实例。,如何提高初级代谢产物的产量？1、使用诱导物2、除去诱导物选育组成型产生菌3、降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生4、解除分解代谢阻遏筛选抗分解代谢阻遏突变株5、解除反馈抑制筛选抗反馈抑制突变株6、防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株,7、改变细胞膜的通透性8、筛选抗生素抗性突变株9、选育条件抗性突变株10、调节生长速率11、加入酶的竞争性抑制剂,如何提高次级代谢产物的产量？,1、补加前提类似物2、加入诱导物3、防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生4、防止氮代谢阻遏的发生5、筛选耐前体或前体类似物的突变株6、选育抗抗生素突变株7、筛选营养缺陷型的回复突变株,如青霉素G的生产中，苯乙酰-CoA是限速因子；补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。次级代谢产物形成中并不是所有前体类似物都是限速因子。加入前体提高产量的效果更取决于总体代谢的调节水平。,如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素C。,链霉素、氯霉素、金霉素等多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白的能力。一株高产抗生素产生菌，必然应具备对自身所分泌的抗生素的抗性。,
