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1、第八章 发酵产物的提取与精制P171,一、下游加工工程概述,经过了菌种选育、发酵生产之后，得到了发酵产物。微生物工程产品的生产中，分离和纯化是最终获得商业产品的重要环节，相对于菌种选育和发酵生产这些上游技术，分离纯化技术被称为下游加工工程（downstream processing）,（一）下游加工工程的特点1、发酵液是复杂的多相系统，从中分离所需产品困难大。2、发酵产品在培养液中具有浓度低，稳定性差，对酸碱等外界环境十分敏感，容易失活。3、下游加工过程代价昂贵，产品回收率不是很高。,（二）下游加工过程的基本原理,主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性
2、、电荷和与其他分子的亲和性等。各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析及高速与超速离心。,（三）、下游加工工程的一般程序,大多数下游加工工程按生产过程分为四大框架步骤：1 发酵液的预处理和过滤2 提取（初步纯化）3 精制4 成品加工,发酵液,预处理,加热调pH絮凝,细胞分离,细胞破碎,碎片分离,沉降离心分离过滤,均化研磨融胞
3、,离心分离萃取过滤,提取,精制,成品加工,浓缩超滤冷冻干燥结晶,层析吸附电泳,沉淀吸附萃取超滤,下游加工的工艺流程和技术,胞内产物,胞外产物,1、初步分离纯化（1）特点：粗提取液中物质成份十分复杂。欲制备的生物大分子浓度很稀。物理化学性质相近的物质很多。希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。（2）对所选方法的要求：要快速、粗放。能较大地缩小体积。分辨力不必太高。负荷能力要大。,（3）可选用的方法：吸附；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；亲和层析等。旋转蒸发,2、精制分离纯化可选用的方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等
4、。,二、发酵液的预处理P172,发酵液的预处理的目的就是改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中（多数是液相）。,1、高价无机离子的去除 P175 用相应的试剂与高价无机离子反应产生沉淀去除。如除去钙离子，加入草酸(COOH)22H2O 除去镁离子，加入三聚磷酸钠Na5P3O10 除去铁离子，加入黄血盐K4Fe(CN)6,2、改变发酵培养物的过滤特性P173（1）、降低液体粘度加水稀释加热升温 酶解法,（2）、凝聚与絮凝凝聚：在中性盐作用下，由于胶体粒子之间双电子层排斥电位的降低，使胶体体系不稳定出现聚集絮凝:有些无机和有机高分子化合物长链的架桥作
5、用使胶体成团聚结而沉淀，称为絮凝。）,（3）、调整发酵液pH,氨基酸、蛋白质：调等电点,（4）、加入反应剂,利用反应剂和某些可溶性盐类反应生成不溶性沉淀，消除杂质对发酵液影响。如：环丝氨酸发酵液加入氧化钙和磷酸盐处理，生成磷酸钙沉淀，使悬浮物凝固，多余的磷离子可去除钙、镁离子，并且发酵液不会引入其他阳离子,（5）、加入助滤剂,助滤剂作为胶体粒子的载体，均匀分布于滤饼中，改变滤饼结构，降低滤饼可压缩性，减少过滤阻力常用助滤剂：硅藻土、珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、白土等。,三、固液分离-过滤P175,发酵液通过过滤器，形成滤渣，滤渣为可压缩性的,也称为可压缩性滤饼。衡量过滤特性的主要
6、指标是滤饼的质量比阻力B.，它表示的是单位滤饼厚度的阻力系数B.=（p）m 不可压缩性滤饼的比值，对一定的料液其值为常数m-压缩性指数一般取0.50.8，对不可压缩性滤饼为0p 压力差,框式压滤机（手动压紧）,过滤仪器,四、微生物细胞破碎,处理量大，破碎速度较快。大多数情况下要采取冷却措施，防止生化物质破坏。机械法主要运用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的。,（一）、机械法,球蘑机的粉碎球和机器,匀浆机,组织粉碎机,.高压匀浆法由可产生高压的正向排代泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。原理：细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高
7、速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。,适用范围：适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。特点：在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。,、X-press法（挤压器）将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25至-30形成冰晶体，利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。原理：细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。主要用于实验室中。优点：适用的范围广、破碎率高、细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，缺点：对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。,3、超声波破
8、碎法超声波破碎也是应用较多的一种破碎方法。通常采用的超声波破碎机在15-25千赫（kHz）的频率下操作。原理：细胞的破碎是由于超声波的空穴作用。这种空穴泡由于又受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘附性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。缺点：容易引起温度的剧烈上升，操作时可以在细胞悬浮液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。,特点：杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌易破碎，酵母茵效果较差。菌体浓度太高或介质黏度高，均不利于超声波破碎。应用范围：产生的热量不容易驱散在实验室和小规模生产中是一种很好的方
9、法。,1、酶解法原理：酶解法是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。特点：可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。酶解作用需要选择适宜的酶和酶系统，并要控制特定的反应条件，如温度和pH。某些微生物体可能仅在生长的某一阶段或生长处于特定的情况下，对酶解才是灵敏的。有时还需附加其他的处理，如辐射、渗透压冲击、反复冻融或加金属螯合剂EDTA等，或者利用生物因素促使酶解作用敏感以获得一定的效果。,（二）、非机械法,优点：发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等缺点：酶水解价格高。,2、自溶法原理：利用生物体自身产生的酶来溶
10、胞，而不需外加其他的酶。诱发产生过剩的水解细胞壁上聚合物的酶或激发产生其他的自溶酶，达到自溶目的。方法：加热法或干燥法。例如，酵母细胞的自溶需在4550温度下保持1224h：优点：在一定程度上能用于工业规模，缺点：对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。,3、渗透压冲击法原理：较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出细胞发生收缩，达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。特点：对较脆弱的细脑壁，或者细胞壁预先用酶处理、或胞壁合成受抑
11、制、强度减弱时才是合适的。,4、冻结-融化法原理：将细胞放在低温下冷冻(约15)，然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。特点：对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。缺点：通常破碎率很低，即使反复多次也不能提高收率。还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。,5、干燥法原理：经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。方法：干燥法的操作可分空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。适用范围：空气干燥主要适用
12、于酵母菌，一般在2530的热气流中映干，然后用水、缓冲液或其他溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥、喷雾干燥容易抽提。真空干燥适用于细菌的干燥，把干燥成块的菌体磨碎再进行抽提。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质，在冷冻条件下磨成粉，再用缓冲液抽提。缺点：干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其他组织变性。,6、化学法常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。原理：酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6molL HCl。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。有机溶剂能溶解细胞壁的磷脂层，使细胞结构破坏。,优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完
13、整、碎片少、核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。缺点：容易引起活性物质失活破坏；化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。,五、沉淀法,沉淀法是通过改变条件或加入某种试剂使溶液中的溶质由液相转变为固相析出的过程。用于生物物质的初步分离,在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应
14、用较少，多与其他方法结合使用。,1、盐析法 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。对许多生物活性物质具有稳定作用。,中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（04）进行。由下表可以看到，硫铵在0时的溶解度，
15、远远高于其它盐类：表 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）0 20 80 100（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101,盐析的影响因素1)蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.53.0，相当于25 mg/mL30mg/mL。2)pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。3)温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽
16、等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力丧失。,2、有机溶剂沉淀法 基本原理 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走
17、了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。,（2）有机溶剂沉淀法的优点 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。（3）有机溶剂的选择和浓度的计算 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。,（4）有机溶剂沉淀的影响因素 1
18、)温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。2)样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。通常使用5mg/mL20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。,3)pH值：选择在样品稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。4)离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过5为
19、宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。,3、选择性变性沉淀法 这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯。热变性 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。表面活
20、性剂和有机溶剂变性 使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。选择性酸碱变性 利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。,4、等电点沉淀法 利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果
21、。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。,六、溶剂萃取法,定义：以分配定律为基础的，利用各种物质在不同的溶剂中具有不同的溶解度的原理，来达到将不同物质分离纯化的目的。用于生物物质的初步分离,不仅对抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物常采用有机溶剂萃取法进行提取，而且近年来又开发了不使酶等蛋白质失活的双水相萃取法，已成功地应用于提取甲酸脱氢酶、葡糖苷酶等，但因为聚乙二醇、葡聚糖等价格较贵，所以还未广泛使用。,（一）溶剂萃取的原理分配定律 在一定的温度和压力下，溶质分配在两不相容的溶剂中，达到平衡时，溶质在两相的浓度之比为一常数K K=CL/CR=萃取液浓度/萃余液浓度,对
22、于发酵液中的两种物质（A和B）而言，A、B两者的分配系数不同则萃取相中的相对浓度不同。假如A的分配系数高于B，萃取相中A的浓度就比B高，这样两者就得到了一定的分离。分离因素=KA/KB,（二）溶剂的选择,一般来说，在大规模生产之前，必须先通过小型试验，了解产物在各种溶剂中的溶解度。试验遵循一个简单的规律；“相似物容易溶解在相似物中”，即分子的极性。极性液体互相混和并溶解盐类和极性固体，而非极性化合物溶剂是低极性或没有极性的液体。,（1）水：为极性最大的溶剂，也最常用。可溶解苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、有机酸盐、亲水性色素、无机盐。其中蛋白质不溶于热水。缺点：用水提
23、取易酶解苷类成分，且易霉坏变质。某些含果胶、粘液质类成分的中草药，其水提取液常常很难过滤。沸水提取时，中草药中的淀粉可被糊化，而增加过滤的困难。故含淀粉量多的中草药，不宜磨成细粉后加水煎煮。（2）亲水性的有机溶剂：以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。优点：应用范围广，易过滤，不霉变，易浓缩回收。缺点：价高、不安全，需回流设备。,（3）亲脂性的有机溶剂：这些溶剂的选择性能强，用于亲脂性成分的提取，如游离生物碱、苷元、挥发油等。优点：提取专属性强，易回收浓缩。缺点：价高、易燃、有毒，穿透性差；对设备要求高。,生物工业上常用
24、的溶剂有乙酸乙酯、乙酸丁酯和丁醇等。,（三）萃取方法,生产中萃取操作一般应包括下面三个过程：(1)混合料液和萃取剂密切接触；(2)分离萃取相与萃余相分离；(3)溶剂回收萃取剂从萃取相(有时也需从萃余相)中除去，并加以回收。因此在萃取流程中必须包括混合器、分离器与回收器。,根据混合-分离的操作方式，可以分为单级萃取和多级萃取。1、单级萃取 只包括一个混合区和一个分离器的萃取流程称为单级萃取。,F：料液S：溶剂L：萃取液R：萃余液,2、多级萃取操作方式不同又分为多级错流萃取和多级逆流萃取,在多级逆流萃取中，在第一级中加入料液，并逐渐向下一级移动，而在最后一级中加入萃取剂，并逐渐向前一级移动。,对赤
25、霉素采用二级错流萃取时，产品理论得率为98.78%，采用二级逆流萃取时，产品理论得率为99.7%。,七、双水相萃取法,双水相萃取现象最早是1896年出Beljcrnck在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时发现的，这种现象称之为聚合物的“不相溶性”(incompnuNlITy)。本世纪60年代瑞典Lund大学的Albertson PA及其同事们最先提出了双水相萃取技术并做了大量的工作。70年代中期西德的Kula，MR和Kloner K等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液个提取酶和蛋白质，大大地改善胞内酶的提取效果。,双水相的形成 绝大多数天然的或合成的亲水性聚合物水溶液，在与第二种亲水性聚合物混合，
26、并达到一定浓度时就会产生两相，两种高聚物分别溶于互不相溶的两相中。如用等量的11右旋糖酐溶液和0.36%甲基纤维素溶液混合，静止后产生两相，上相中含右旋糖酐039，合甲基纤维素065%，而下相含右旋糖酐158，含甲基纤维素0.15。,一般认为，成相是由于高聚物之间的不溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，无法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离倾向在一定条件可分为两相。近年来义出现某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混时，只要浓度达到一定范围，体系也会形成两相。,在以上的双水相体系中，各种细胞、噬茵体等的分配系数或大于l00，或小于001蛋白质(如酶)的分配在01至10之间；无机盐的分配系数一般接近于1.0。这种不同物质分配系数的差异，构成了双水相萃取分离物质的基础。,举例：酶的分离实际应用的体系为PEG/盐体系一般酶主要分配在上相中，菌体碎片在下相或界面，酶的回收率在90%以上。,作业,1、细胞破碎常用的方法及各种方法的优缺点。2、下游加工的步骤,
