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1、第四章 微生物的营养和培养基,营养物：生物体为满足正常生长、繁殖，从外界吸收的作为代谢活动必需的有机物和无机物。营养：获得并利用营养物质的过程。,微生物的营养物质：能够满足微生物的生长繁殖和完成其各种生理活动所需要的物质称为微生物的营养物质。微生物的营养物质来源除无机、有机物质外，还包括光能这种非物质形式的能源。,第四章微生物的营养和培养基,第一节微生物的营养第二节微生物的培养基第三节微生物的生存因子,第一节 微生物的营养,一、微生物的营养类型二、微生物的营养要求,营养类型是指根据微生物生长所需要的主要营养要素即能源和碳源的不同，而划分为：光能自养型光能异养型化能自养型化能异养型,一、微生物的
2、营养类型,营养类型,能源,碳源,电子供体,代表类型,光能自养型,光,CO2,无机物H2S、S、H2或水,绿硫细菌,光能异养型,光,有机物,有机物,红螺细菌,化能自养型,无机物,CO2、碳酸盐,无机物（H2S、H2、Fe2+、NH4+、NO2-）,硝化细菌,化能异养型,有机物,有机物,有机物,大肠杆菌,微生物的营养类型,光能自养型蓝细菌含叶绿素a，利用水作为供氢体，在光照下同化二氧化碳，并放出氧气。,光能自养型念珠蓝细菌电镜照片,光合作用,光能异养型以光为能源，以有机碳化合物作为碳源和供氢体进行光合作用而生长繁殖的微生物。,光能异养菌紫色非硫细菌电镜照片,化能自养型以二氧化碳为碳源，利用无机化合
3、物（如铵、亚硝酸盐、硫化氢、铁离子等）氧化过程中释放出的能量进行生长的微生物。,产甲烷细菌电镜照片，它们可以氢气为能源，二氧化碳为碳源生长,化能异养型大多数微生物属于这种营养类型。它们以有机碳化合物作为碳源和能源。如果微生物的食物是来自死亡或腐烂的动植物尸体，就称其为腐生微生物。如果其生长必须从活细胞或组织中获得营养物质的，则称之为寄生微生物。,腐生型微生物枯草芽孢杆菌,二、微生物的营养要求水碳源氮源无机盐生长因子,1、水是维持细菌细胞结构和功能必不可少的一种重要物质,水是细胞的一种主要成分，一般占微生物营养体重量的百分比：细菌80%左右、酵母菌75%左右、霉菌85%左右；霉菌孢子含水约39%
4、、细菌芽孢核心部分的含水量低于30%。,水的生理功能（1）水是细胞的重要组成成分。（2）水直接参与代谢反应，许多反应都涉及脱水和水合。（3）水为细胞提供液体介质环境。细菌的营养物质、代谢产物都必须溶于水中才能被运输。（4）水比热高、是热的良导体，可调节细胞的温度。（5）维持 蛋白质核酸的天然构象稳定。,2、碳源,定义：为微生物生长提供碳素来源营养物质的统称,功能：提供合成细胞骨架及代谢产物的原料;并为整个生理活动提供所需要能源,微生物利用的碳源物质主要有糖类、有机酸、醇、脂类、烃、CO2及碳酸盐等。微生物最好的碳源是糖尤其是葡萄糖、蔗糖。对于为数众多的化能异养微生物来说，碳源是兼有能源功能营养
5、物。,凡是能够供给微生物氮素营养的物质称为氮源。氮源的作用是为蛋白质的合成提供原料。,3.氮源,氮源,氨基酸蛋白质核 酸尿 素,有机氮,无机氮,硝酸盐铵 盐NH3N2,速效氮源：小分子氮源（铵盐和氨基酸），很容易被细菌吸收利用，在短时间内就可满足菌体生长需要，称之为速效氮源迟效氮源：大分子复杂氮源（硝酸盐和蛋白质），需要被细菌还原或降解后才能够利用，称为迟效氮源,固氮作用细菌吸收并利用环境中的游离氮气作为氮源，借助特殊的酶将分子态的氮转化为氨或其它含氮化合物，该过程被称为固氮作用。固氮酶 N2+H2-NH3,按对氮源的要求不同，微生物可分为：,1.固氮微生物利用空气中的N2合成自身所需的氨基酸
6、及蛋白质。代表：根瘤菌、固氮蓝菌、固氮菌。,2.以无机氮化物为氮源的微生物利用NH3、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐为氮源。代表：亚硝化菌、硝化菌、放线菌、霉菌等。,按对氮源的要求不同，微生物可分为：,3.以某种氨基酸为氮源的微生物速效氮源也为异养微生物，不能利用无机氮合成蛋白质，只会利用现成的氨基酸合成。代表：乳酸菌、丙酸细菌等。,4.以分解蛋白质而获得氮源的微生物迟效氮源把蛋白质分解后，形成NH3、氨基酸和肽，然后根据自己所需再次形成蛋白质。代表：氨化细菌、霉菌、酵母菌等。,4.无机盐,作用,1.细胞组成部分；2.构成酶的组分和维持酶的活性；3.调节渗透压、pH、氧化还原电位；4.能源；5.酶的激
7、活剂；,微量元素:是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素。通常需要量在106108mol/L。如：锌、锰、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。,根据微生物对矿质元素需要量大小可以把它分成:,大量元素：P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe等。,1）PP对于微生物的作用很重要，所有的微生物都需要磷源。a.合成核酸、核蛋白、磷脂及其他含磷物质的重要元素。b.是一些辅酶的组成部分。如：NAD、ATP、ADP等。c.在磷酸化中起作用。d.高能磷酸键。e.缓冲剂。2）SS是一些氨基酸的组分，一般为硫氢基（SH）的形式。S及硫化物是好氧微生物的能源。,5.生长因子,生长因子：那
8、些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成的或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。生长因子主要有：维生素C、B维生素、氨基酸、碱基对等。,第二节、微生物的培养基,培养基是人工根据微生物得营养要求，将水、碳源、氮源、无机盐、生长因子等物质按照一定得比例配制的，用以培养微生物（生长繁殖或产生代谢产物）的营养基质。,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。任何培养基都应该为微生物生长提供五大营养要素。,一、培养基的配置原则二、培养基的类型及应用,一、配置培养基的顺序和原则,目的明确,营养协调,理化条件适宜,经济节约,2.配置培养基的原则,1.配置培养基的顺序,各成分的顺序
9、：1).缓冲化合物；2).无机元素；3).微量元素；4).生长因子。最后调节pH。,无菌,3).营养协调,培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用。,培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。,2).目的明确,根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。,1).无菌,例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培养基碳氮比为4/1时，菌体量繁殖，谷氨酸积累少；当培养基碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。,培养基的
10、pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。,通常培养条件：细菌与放线菌：pH77.5酵母菌和霉菌：pH4.56范围内生长,为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，如K2HPO4或在进行工业发酵时补加酸、碱。,4).理化条件适宜 pH,二、培养基的类型及应用,培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。,按成分不同划分,化学成分完全了解的物质配制而成的培养基,按照物理性质分,固体培养基培养液加入2%-3%的琼脂用于微生物分离纯化、保存、计数半固体培养基培养液加入0.5%琼脂用于观察细菌的运动能力，保存菌种液体培养基培养液中
11、不加琼脂用于观察微生物生长状况、检测生化反应及代谢产物，大量增殖细菌,根据培养基的物理状态，培养基可分：,+,1.5-2.5%琼脂,固体培养基:,0.3-0.5%琼脂,用于大量繁殖细菌,+,动力检查,细菌的分离培养,半固体培养基:,液体培养基:,按照用途和使用目的不同分为基础培养基满足一般细菌生长繁殖所需条件，组成牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、水营养培养基培养基中加入血清等特殊成分供有特殊营养要求的细菌生长鉴别培养基加入糖类指示剂，鉴别细菌种类选择培养基加入抑制某些细菌生长的药物，筛选出目的细菌厌氧培养基培养厌氧菌,营养培养基在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清等，专供营养要求较高或有特殊要求的细
12、菌生长，如肺炎链球菌和溶血球菌必须在血琼脂平板上生长。,血琼脂平板,鉴别培养基是检查细菌生化反应的培养基，以作细菌鉴别之用。例如：在蛋白胨水中加入某种糖类和某种指示剂，细菌培养后，可根据产酸产气情况来鉴别细菌分解糖的发酵能力。,鉴别培养基：利用几种细菌对某一物质的分解能力不同，借助指示剂的显色不同进行菌种鉴别和区分的培养基。如：大肠杆菌中的大肠埃希氏菌、枸橼酸盐杆菌、产气杆菌、副大肠杆菌四个，对乳糖的分解能力不同。其中副大肠杆菌不能分解，大肠埃希氏菌最强，菌落呈紫红色且带金属光泽；枸橼酸盐杆菌次之，菌落呈紫红色或深红色；产气杆菌最低，菌落呈淡红色。,选择培养基：利用微生物对某些物质的敏感程度不
13、同，在培养基中加入一些敏感物质，这样就可以利用这些物质来抑制非目的性微生物的生长，从而使得所需的微生物大量繁殖。如：在培养基中有革兰氏阴性菌也有革兰氏阳性菌，但想培养的是革兰氏阴性菌，就可以加入胆汁酸盐，抑制阳性菌的繁殖。,高温下培养，分离嗜热细菌；,待分离的微生物生长，其它的微生物不长,培养基中加抗生素分离抗性菌,培养基中不含氮，分离固氮菌；,如何利用选择培养基选择出能降解对羟基苯甲酸的细菌？,想一想：,厌氧培养基专供厌氧菌的分离、培养和鉴别。常用：庖肉培养基（肉汤中加入煮过的肉渣，其中含有还原性的不饱和脂肪酸和谷胱甘肽),基础液体培养基,石蜡,普通肉渣,+,庖肉培养基,第三节 微生物的生存
14、因子,微生物正常生存，需要营养，除此以外，还需要合适的温度、pH、氧气等环境条件。,一、温度对微生物生长的影响二、氧气对微生物生长的影响三、pH值对微生物生长的影响,温度是影响微生物生长的最重要因素之一。具体影响表现在：影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度，对生长有影响。,一、温度对微生物生长的影响,每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度。最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度
15、。,处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。超过最低或最高生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。,（一）微生物生长的三个温度基点,低温、中温和高温细菌的生长温度范围,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：,（二）微生物生长温度类型,低温型微生物嗜冷菌，最适合在515，甚至很多细菌可以在0以下正常生存。冰箱中冷藏的蔬菜、水果发霉变质腐烂的原因。,中温型微生物：最适生长温度为2040，大多数微生物属于此类。室温型主要为腐生或植物寄生，在植物或土壤中。体温型主要为寄生，在人和动物体内。,所有微生物中，多部分是嗜中温菌，污水处理系统中，为了保证微生物能够处于较好的工作状
16、态，需要为其提供较适合的温度。一般控制在2030左右。冬天，需要进行加热处理。,高温型微生物：最适生长温度为50 60,主要分布在温泉、堆肥和土壤中。,高温微生物的特点:生长速度快，合成大分子迅速，可及时修复高温对其造成的分子损伤。耐高温菌在减少能源消耗、减少染菌、缩短发酵周期等方面具重要意义。,菌 名生长温度发酵温度累积产物温度（）（）（）Streptococcus thermophilus 374737S.lactis 3440产细胞：2530产乳酸：30Penicilium chrysogenum 302520以青霉素的生产为例：培养165小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在
17、30 培养提高了14.7%。分段控制方式：05小时，30；540小时，25；40125小时，20；125165小时，25。,微生物不同生理活动要求不同温度，所以，最适生长温度 发酵速度快、积累代谢产物多。,1、高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。,（三）高温与低温对微生物的影响,当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物受到抑制，生长繁殖停止，但由于微生物的原生质结构并未破坏，并未造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中
18、。当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡,2、低温对微生物的影响,造成死亡的原因：冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。冻结速度对冰晶形成有很大影响，缓慢冻结，形成的冰晶大，对细胞损伤大；快速冻结，形成的冰晶小、分布均匀，对细胞的损伤小；因此，利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏，一般情况下在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。,因此，微生物的培养应该在最佳温度范围进行。超过最高温度会对细菌造成伤害甚至导致死亡。低温有抑制细菌作用。可以让微生物休眠，但不会导致死亡。温度升高时，活性即可恢复。,氧化还原电位用Eh表示，单位为V或m
19、V。氧化环境时，Eh为正，充满氧气时，上限为+820mV；还原环境时，mV为负，充满氢气时，下限为-400 mV。,不同微生物要求的氧化还原电位不同：1.一般好氧微生物：+300+400 mV，大于+100 mV，才能生活。2.兼性菌：+100 mV为界，大于时进行好氧呼吸，小于时进行无氧呼吸。3.厌氧菌：200250 mV。,二、氧气对微生物生长的影响,对于污水处理中的好氧生物处理系统，Eh 处于+200+600mV视为正常。如果出水中Eh下降，处理效果不佳。,氧化还原电位的影响因素,受氧分压的影响：氧分压高，氧化还原电位高；氧分 压低，氧化还原电位低。在培养微生物过程中，由于微生物生长繁殖
20、消耗了大量氧气，分解有机物产生氢气，使氧化还原电位降低，在微生物对数生长期中下降到最低点。,受环境中pH的影响：pH低时，氧化还原电位低，pH高时，氧化还原电位高。,微生物与O的关系,好氧微生物,厌氧微生物,兼性微生物,专性好氧微生物,微好氧微生物,专性厌氧微生物,耐氧厌氧微生物,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2）等。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解这些产
21、物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说：,各类菌所含对氧解毒酶,专性好氧菌 SOD，过氧化氢酶 兼性厌氧菌 SOD，过氧化氢酶 专性厌氧菌 二种酶均无 微好氧菌 少量SOD 耐氧菌 SOD,（一）好氧微生物,必须有氧才能生存，氧气对于好氧微生物的作用：1.最终电子受体；2.参与物质合成,好氧微生物做好氧呼吸时，会产生毒害物质如：过氧化氢、过氧化物和羟自由基等。但由于好氧微生物体内也有相应的酶可以分解上述物质，因此，好氧微生物可以在氧气条件下正常生存。,好氧微生物所需要的氧气是
22、溶解在水中的氧气，即DO。溶解氧与大气压力及温度有关，温度越高，溶解氧越低。,好氧生物处理系统中，为了保证微生物的正常工作，必须为它们提供足够的溶解氧。工程上，通常采用鼓风曝气的形式向水中强制充氧，对于生活污水厂，BOD5200300mg/L。如果曝气池的活性污泥浓度在20003000mg/L时，溶解氧必须保证在2mg/L以上。通常控制在34mg/L。当供氧不足时，会造成污泥的丝状菌膨胀。,（二）厌氧微生物可分为两种，一种有氧就要死亡；另一种，有氧无氧无所谓，生活过程中，不会中毒也不利用氧。通常说的厌氧菌多指第一种，称为专项厌氧菌。它在有氧条件下，代谢过程中会产生过氧化氢，但体内不具有过氧化氢
23、酶，专性厌氧微生物将被过氧化氢杀死。,厌氧微生物在培养时，培养基必须保证无氧。方法：惰性气体驱氧：氮气或氦气。用胶塞密封培养装置，并在容器中加入氧化还原性颜料（甲基蓝或刃天青），当在还原态时无色，氧化态时显色。一旦显色，说明有氧存在。也可在培养装置中预先加入些兼性微生物混合培养，一旦有氧，可被兼性细菌消耗掉。,（三）兼性厌氧菌有氧无氧都能生存兼性菌的作用：污水处理时，若溶解氧充足，好氧菌与兼性菌都起作用，当供氧故障时，兼性菌仍可起作用，但不如有足够溶解氧时处理效果好。,氧气与微生物的关系,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧
24、气。培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时在培养基中添加还原剂，降低培养基中的氧化还原电势。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,微生物也有最适应的pH 范围，微生物不同，pH范围不同。多数细菌：最佳6.57.5，适应范围410；一般要求中性或偏碱性；放线菌：最佳7.58.0，一般要求中性或偏碱性；霉菌和酵母菌：可在酸性或偏碱性环境生活，最喜欢36的环境。生长极限：1.510。,三、pH值与微生物生长的相互影响,一些微生物生长的pH值范围,污水处理生物处理构筑物内pH控制在6.58.5之间。微生物培养基中应该加入缓冲物质。污泥厌氧处理时，也要控制好pH，一般在6.67.6，最好控制
25、在6.87.2之间。,污水处理时的PH控制,微生物 pH值 最低 最适 最高Thiobacillus thiooxidans 氧化硫硫杆菌 0.5 2.03.5 6.0Lactobacillus acidophilus 嗜酸乳杆菌 4.04.6 5.86.6 6.8Rhizobium japonicum 大豆根瘤菌 4.2 6.87.0 11.0Azotobacter chroococcum 圆褐固氮 4.5 7.47.6 9.0Nitrosomonas sp.硝化单胞菌 7.0 7.88.6 9.4Acetobacter aceti 醋化醋杆菌 4.04.5 5.46.3 7.08.0Sta
26、phylococcus aureus 金黄葡球菌 4.2 7.07.5 9.3Chlorobium limicola 泥生绿菌 6.0 6.8 7.0Thurmus aquaticus 水生栖热菌 6.0 7.57.8 9.5Aspergillus niger 黑曲霉 1.5 5.06.0 9.0一般放线菌 5.0 7.08.0 10.0一般酵母菌 3.0 5.06.0 8.0,不同微生物的生长pH值范围,同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌 在pH值=5.57.0时，以菌体生长为主 在pH值=4.35.3时，进行丙酮丁醇发酵同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不同的代谢产物。例如：黑曲霉pH值=23时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。pH值在7左右时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。,生长的最适pH值与发酵的最适pH值,几种抗生素产生菌的生长与发酵的最适pH 微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH 灰色链霉菌 6.36.9 6.77.3 红霉素链霉菌 6.67.0 6.87.3 产黄青霉 6.57.2 6.26.8 金霉素链霉菌 6.16.6 5.96.3 龟裂链霉菌 6.06.6 5.86.1 灰黄青霉 6.47.0 6.26.5,
