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1、急性毒性试验方法,一、急性毒性,急性毒性指人或动物一次或24 h之内多次接触外源化学物后，在短期内所发生的毒性效应，包括致死效应。,一次：指瞬间给实验动物染毒，如经口、经静脉注射染毒。24 h之内多次：指外源化学物毒性过低，需给予动物较大剂量。,急性毒性效应出现的快慢和毒性反应的强度与外源化学物的性质和染毒剂量的大小有关。如：丙烯腈，过氧化二碳酸二环己酯,急性毒性试验目的,了解外源化学物急性毒性的强度，求出LD50了解外源化学物毒作用的性质、毒效应的特征及可能的靶器官，初步评价外源化学物的危险性。探求外源化学物的剂量-反应（效应）关系，为亚慢性毒性、蓄积毒性和慢性毒性及特殊毒性试验染毒剂量的设
2、计和观察指标的选择提供参考。初步了解动物致死的原因，为研究毒作用的机制提供线索，进而为制定中毒急救治疗措施提供依据。,由急性毒性试验可得到两类毒性参数上限参数 是以死亡为终点的毒性，包括绝对致死量、半数致死量、最小致死量、最大耐受量等；下限参数 是以非致死性急性毒作用为终点的毒性，包括急性阈剂量和无作用剂量等。,用小动物试验可求出外源化学物对一种或几种实验动物的急性LD50或LC50;用大动物试验可求出近似致死剂量（approximate lethal dose,ALD）;根据LD50（LC50）值可进行急性毒性分级，以初步评价外源化学物对机体急性毒性大小和急性毒作用的强度。,急性毒性试验项目
3、,急性半数致死量测定半数耐受限量测定7d喂养试验其他：近似致死量试验、固定剂量法、急性毒性分级法、阶梯法、金字塔法、限量试验、急性系统毒性试验等。,急性毒性试验设计,实验动物选择品种品系个体 性别 年龄 体重 生理病理状况 对外源化学物毒性反应与人近似；易于饲养管理，方便实验操作；易于获得，品系纯化，价格低廉。,原则,实验动物的年龄与体重的关系,动 物 大鼠 小鼠 豚鼠 兔 犬 猫成年年龄（周）3 2 2 34 34 34 体重（克）150 15 250 1.5kg 715kg 1kg寿命（年）23 23 68 49 1520 1012,急性毒性试验的动物体重,大鼠 120150小鼠 1822
4、豚鼠 200250家兔 22.5 kg犬 1015kg（成年）变异范围不得超过所用动物平均体重的10。,急性毒性试验的动物要求,动物数量：小动物46组，每组至少10只；犬等大动物每组6只。性别：雌雄各半，也有例外，如，致畸试验的剂量准备，只作雌性动物LD50。年龄：刚成年，未曾受孕、交配,实验动物的标记,染色法 耳缘孔口法 烙印法 挂牌法,染色法,用不同颜色的染料涂擦于动物不同部位来 表示不同号码，适用于大鼠、小鼠和豚鼠。常用染料：35苦味酸酒精饱和液，呈黄色；甲基紫酒精饱和液，呈紫色；0.5中性红或品红溶液，呈红色等。,实验动物的标记,方法一：按右前肢、右肋、右后肢、颈部、背中、尾根、左 前
5、肢、左肋、左后肢，顺序编号为19号，不染色 为10号。在动物相同部位涂染另一种颜色染料表示 十位，两种颜色可编199号。方法二：以头部为1号，顺时针方向依次从右耳、右前肢、右 后肢、颈部、背中、尾根、左耳、左前肢、左后肢 染色，分别为210号。,染色法,优点：简单方便，不痛苦，无损伤。缺点：时间较长时，染色剂易褪色；标记容易模糊不清。,耳缘孔口法：在耳缘先用针穿孔和用剪刀剪口，再用酒精墨汁涂抹，使黑色渗入孔口，伤口愈合后不易脱落，这种标号亦可标号。适用于大、小鼠。,烙印法：将铸铁号码加热后，在动物体表部位烧烙，以破坏毛囊，留下印记。适用于大动物。挂牌法：用金属或塑料制成号牌，固定在动物的耳部或
6、系于其颈部。适用于较大动物。,实验动物分组,目的：减少个体差异对实验结果的影响；原则：按统计学原则随机分组，使非处理因素最大限度地保持一致，提高每组实验动物间的均衡性。常用方法：完全随机和随机区组,完全随机设计,将实验动物编号，从随机数字表上任意横行或纵行的任意数字开始，顺序取下数字，标于每个动物号下，然后用计划组数去除随机数字，所得余数即为所属组别。如将只动物分为组，从随机数字表的第行开始，顺序取个数字，用除的余数即为组别。,20只动物的完全随机分配,完全随机分配后各组所属动物号,20只动物完全随机分配的结果,20只动物的完全随机分配,完全随机分配后各组所属动物号,20只动物完全随机分配的结
7、果,随机区组设计,将动物称重，按体重顺序依次排列编号，分成若干个区组，每一区组的动物体重相近，每一区组的动物数即为组数。再从随机数字表上任意抄下随机数字，依次标在每个动物的编号下，如欲将动物分为组，则将每一区组动物编号下的随机数字，按顺序分别用、除之，根据余数大小将动物分入各组。,原则是余数即为所属组别，余数0属最后一组。当同一区组中有相同余数时，非0余数按顺序分配至未分配动物的首位组，而0余数则按顺序分配至未分配动物的末尾组。如下表第一区组中，第一个余数是0，将1号大鼠分到第4组；第2个余数为1，2号大鼠分到第1组；第3个余数仍为1，未分配动物的第2组居首位，故将3号大鼠分到第2组；余下4号
8、大鼠则分到第3组。优点：各组的动物数目相等，动物平均体重相近，可以减少实验误差；动物数目较多时比完全随机法快。,20只小鼠按随机区组设计分组表,随机分配到各组的动物,剂量选择及分组,剂量选择 广泛查阅文献资料，估计毒性中值预试，求出待测化学物0%100%或 10%90%的大致致死剂量范围设计正式试验的剂量和分组,剂量分组,ilgLD100-lgLD0/n-1 或ilgLD90-lgLD10/n-1n：设计的剂量组数 i：组距，相邻两个剂量组对数剂量 之差,受试物的配制,溶剂的选择配制方法等容量稀释等浓度稀释,受试物的配制,等容量稀释：要求不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同时，就将受
9、试物配成不同浓度。等比稀释法（1：k）等浓度稀释：将受试化学物配成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试化学物的体积不同。,试验期限及观察指标,观察期限为714d求LD50时，目前国内外一般要求计算实验动物接触外源化学物后14 d内的总死亡数对于速发性死亡的化学物也可只计算24 h的死亡数，如久效磷24 h与14 d的LD50没有差别,观察指标,中毒症状：确定靶器官 行动：不安定、多动、发声；神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失调、姿态异常；自主神经系统反应：眼球突出、流涎、流泪、排尿、下泻、竖毛、皮肤变色、呼吸。体重：隔日测量死亡和死亡时间 病理学检查及其他指标,LD50的计算,LD
10、50测定是以动物死活为指标的质反应，当死亡呈正态分配时，一般具有以下特点：剂量对数值与动物死亡频数之间为正态分布曲线关系；剂量对数值与死亡率之间为正“S”型曲线；从实验数据可计算LD50以外的其它信息。,对数剂量,剂量,曲线：中间高、两侧低，右侧延长较远,正态曲线,中 点,中 点,计算LD50的常用方法:概率单位法Bliss法改良寇氏（Krber）法等,LD50的计算公式,校正公式,LD50的标准误,LD50 的95%可信限,LD50 的95%可信限=log-1(log LD501.96Sx50),i组距，即相邻两组剂量对数剂量之差Xm最大剂量对数P各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示)Pm最高
11、死亡率q各剂量组存活率，q=1-pPn最低死亡率p各剂量组死亡率之和n各组动物数Sx50logLD50的标准误,寇氏原法：要求最小剂量的反应率（P）为0，最大剂量反应率（P）为100，结果才精确。改良寇氏法只要求在最小剂量时P0.2，最大剂量p0.8即可。还要求每个剂量组的组间距呈等比或剂量对数等差，每个剂量组动物数相等，中间剂量接近于LD50。,九灵胃康在小鼠的经口急性毒性试验结果,LD50=log-10.8859-0.11(2.8-0.5)=log-10.6329=4.29（g/kg）Sx50=0.0307 logLD50及其95%可信限=0.63291.960.0307=0.63290.
12、0602 小鼠的经口LD50为4.29g/kg，其95%可信范围 为3.744.93g/kg,急性毒性评价,外源化学物相对毒性分级标准,急性毒性分级（WHO）,鱼类急性毒性分级,LD50的局限性,消耗动物量大获得的信息有限动物死亡和观察的症状不足以反应生理学、血液学和其它化验检查所提供的毒性信息有许多因素影响LD50值的测定，实际上测得的LD50是近似值,LD50所表达的是50%动物存活与50%动物死亡的点剂量，是一个质的现象，而在实际工作中，往往发现有些外源化学物用同一物种、同一品系的实验动物、用相同染毒条件所得到的LD50值相同或相似，但其毒作用带或致死剂量范围却有明显的不同，表明化学物的实际毒性存在差异。,急性毒性试验不等于LD50测定可用少量动物测定ALD，并进行临床观察、化验检查和病理学检查当口服剂量大于5g/kg或注射剂量大于2g/kg时，不产生急性毒性或死亡，则不必准确的测定LD50,FDA认为评价外源化学物的急性毒性时，应在LD50值之外加上急性毒作用带或其斜率进行综合评价，LD50及其斜率在化学物的急性毒性评价中是必不可少的。,化学物急性毒性的报告应详细描述：中毒症状及程度出现症状的时间死亡前的症状及死亡时间存活动物的体重变化死亡动物的病理变化,4种不同外源化学物的毒作用带斜率比较,
