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1、Q&A,关于酶切/连接的结果,预期结果,P V0 V1 V1 M,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp,酶切产物的琼脂糖电泳（1%）,P:双酶切的PCR产物;V0：未酶切的质粒;V1：酶切不完全的质粒;V1:完全酶切的质粒;M:分子量标准（DL2000),我们的结果,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,酶切产物的琼脂糖电泳（1%）Lane14：双酶切的PCR产物Lane69：双酶切的质粒lane 5：未酶切的质粒Lane 10:分子量标准（DL2000),1 2 3 4 5 6 7 A B C D E F G H M,酶切产物的琼脂糖电泳（1%）La
2、ne17：双酶切的PCR产物LaneBH：双酶切的质粒lane A：未酶切的质粒Lane M:分子量标准（DL2000),真不错,我们的结果,4组,5组的PCR酶切,DL15000分子量分布（bp）：15000，10000，7500，5000，2500，1000，250,6组,3组,我们的结果,5组的质粒酶切,7组的质粒酶切酶切,没有切开？还是电泳行为异常？需要鉴定。,Q&A,关于酶切产物的回收 胶回收：更纯，相对回收率低；液体直接回收：相对回收率高。酶的量：酶的星号活力；,感受态细胞的制备 连接产物转化克隆菌株,基因的克隆与表达专题之四,&,pETBlue System：蓝白筛选：其具有的大
3、肠杆菌tet启动子是弱的组成型启动子，驱动 下游LacZ-片段表达实现蓝白筛选；高效可诱导表达：高效表达外源蛋白。pETblue系统可选用NovaBlue(CE6,在PL启动子的驱动下表达T7RNA聚合酶的噬菌体)或TunerTM(DE3)pLacI菌株做宿主菌。这些宿主的基因组上带有lacUV5启动子控制的 T7RNA聚合酶基因，可以实现IPTG诱导。低本底表达：由于T7-lac启动子驱动的外源基因的表达方向与tet启动子驱动的LacZ-片段表达的方向相反，所以此系统基本没有外源基因的本底表达。,Inductive Expression-Introduction,大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳
4、动物细胞、昆虫、酵母、植物实验中，要根据所要表达的蛋白质的大小、蛋白质的需要量、是否需要活性以及实验室的条件等综合考虑选择合适的宿主-载体系统大肠杆菌遗传图谱明确，容易培养，费用低，已有许多成功的先例，是首选的表达系统，但大肠杆菌中缺少翻译后修饰系统，一些修饰后才有活性的蛋白必需选择真核细胞为宿主分离基因 构建重组载体 转化 筛选鉴定 表达与优化表达条件,Inductive Expression-Introduction,表达宿主系统,TunerTM菌株是BL21的lacZY缺失突变株，能够同时调整同一培养体系中所有细胞的蛋白表达水平。lac通透酶（lacY）突变使得IPTG均匀进入群体所有细
5、胞，从而获得浓度依赖的、水平均一的诱导。通过改变IPTG浓度，表达可从极低水平调节到极强的、完全诱导的表达水平（通常与所使用的pET载体相关）。低水平表达可以增强难表达蛋白的溶解性和活性。Tuner（DE3）pLacI菌株可与pETBlue和pTriExTM载体的配合使用。,NovaBlue是一种适合用作初始克隆宿主菌的K-12菌株，具有高转化效率、蓝/白斑筛选能力（与相应的质粒配合使用）和促进质粒DNA高产的recA endA突变。由于存在F附加体编码的lacIq阻遏蛋白，NovaBlue的DE3溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。,BL21是应用最广的宿主菌来源，具有lon和ompT蛋白酶
6、缺陷的优点.（DE3）宿主菌是lDE3溶原菌，染色体上带有一拷贝由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因。这类菌株配合pET载体一起表达。pLysS是带有可以与pET共存的、编码T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的质粒。pLysS 菌株在被诱导前T7 RNA聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使表达会影响宿主细胞生长和活力的重组体在宿主中更稳定。带有pLacI质粒的宿主菌产生额外的抑制pETBlue和pTriEx载体基础表达的lac阻遏蛋白。,Inductive Expression-Introduction,LacI,pETBlue,大肠杆菌基因组,Lac启动子,T7启动子,I
7、PTG诱导,IPTG诱导,大肠杆菌RNA聚合酶,T7 RNA聚合酶基因1,T7RNA聚合酶,T7RNA聚合酶,靶基因,pETBlue系统调控元件,LacI,Lac阻遏物,Lac阻遏物,DE3,LacO,LacO,pLacI,TunerTMDE3LacI,Inductive Expression-Introduction,X-gal：5-溴-4-氢-3-吲哚-D半乳糖苷,制备感受态细胞,预 培 养:(昨天下午),LB培养基（4mL，含12.5g/mL Tet）37、190rpm振荡培养过夜,扩 大 培 养:(今天早晨),0.4mL预培养菌液 40mL LB液体培养基（含12.5g/mL Tet）
8、37、250rpm振荡培养2.5-3小时,收集细胞：,终止培养（OD600 0.4-0.5）转移菌液到50mL离心管中，冰浴10min离心（4，4000rpm 10min）！弃液:倒出培养液，将管倒置使培养液流尽,制备感受态：,穿孔：加入预冷的CaCl2（0.1 mol/L，10mL）轻柔吹悬菌体细胞（用5 mL枪头）冰浴 30min收集：离心(4，4000rpm 5min)，充分弃上清保存：预冷的CaCl2（0.1 mol/L，2mL）冰上轻柔吹悬菌体细胞分装保存：200uL/份（-20 短期或-70 稍长期冻存）,感受态,连接产物转化克隆菌株,1、样品制备 用枪头轻柔混匀，冰上放置30mi
9、n,对照的作用？,注意：无菌！轻柔！冰浴！,2、转化 42 水浴热激90秒 冰浴2分钟3、复苏 每管加800L LB液体培养基 37 慢摇1小时（150rpm）（这段时间铺平板）4、选择性筛选 浓缩菌液：离心（4000rpm 1min）吸弃900uL上清，吹悬剩余细胞 涂 板：取50uL细胞悬液，涂布在选择平板上，倒置培养过夜（37）,复苏目的？,预实验结果,阴性对照,实验平板,仪器使用与注意事项,离心前，一定要在超净台中绝对平衡！,配制液体并高压,LB液体培养基 140mL 胰蛋白胨（tryptone)1.4g 酵母提取物（yeast extract)0.7g NaCl 1.4g140mL水
10、溶解，5mol/L NaOH调节pH值(约28L)分装：250mL锥形瓶，40mL/瓶2瓶 15ml大试管，4 mL/管14管,配制液体并高压,2.LB固体培养基(含1.2琼脂)200 mL LB液体培养基 200 mL 琼脂粉 2.4 g 湿热高温灭菌，待温度降到60左右 加入：Carb(50g/mL)、Tet(12.5g/mL)X-gal(70 g/mL)、IPTG(80mol/L)混匀后立即铺平板10块（约20mL/板）,不用溶解不要挂壁,均为终浓度,下次实验的简介与准备,质粒的提取重组质粒的酶切分析电泳分析重组质粒重 组 质 粒 转 化 表 达 菌 株,重组子的筛选：阳性重组子转化表达菌株,灭菌1.小指管：1.5 mL 60个 2.枪头：20uL/200uL/1mL 各2盒 5 mL 8支3.50 mL离心管 4个下周 1、筛选：每人两个单菌落 2、接菌,Thank you!,
