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1、生物化学实验河南工业大学生物工程学院生物技术系 2015.3,Henan University of Technology,实验内容,1.淀粉含量测定2.氨基酸的纸上层析3.蛋白质分子量测定4.淀粉酶活力测定 5.蛋白质含量测定6.甲醛滴定测氨基氮 7.酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定8.赖氨酸含量测定9.凝胶层析法分离蛋白质10.蔗糖酶的提取与部分纯化11.蔗糖酶活力的测定12.Bradford法测定蛋白质含量,教学目的,生物化学是专业基础实验课，其先修课程为无机化学、分析化学和有机化学。其目的是：学习和掌握生物技术，培养动手观察和思维能力。,学习方法,1、预习：实验前必须进行充分的预习
2、和准备，并写出预习报告，做到心中有数，这是做好实验的前提。2、操作：应按拟定的实验操作计划与方案进行。做到轻（动作轻、讲话轻），细（细心观察、细致操作），准（试剂用量准确、结果及其记录准确），洁（使用的仪器清洁，实验桌面整洁，实验结束把实验室打扫清洁）。3、在实验全过程中，应集中注意力，独立思考解决问题。自己难以解释时可请老师解答。4、写实验报告：做完实验后，应解释实验现象，并作出结论，或根据实验数据进行计算和处理。主要包括：a、目的，b、原理，c、操作步骤及实验性质、现象，d、数据处理（含误差原因及分析），e、讨论，f、思考题回答。,实验室守则,生物化学实验室守则是学生实验正常进行的保证，学
3、生进入实验室必须遵守以下规则：1.进入实验室，须遵守实验室纪律和制度，听从老师指导 2.未穿实验服、未写实验预习报告者不得进入实验室进行实验。3.进入实验室后，要熟悉周围环境，熟悉防火及急救设备器材的使用方法和存放位置，遵守安全规则。4.实验前，清点、检查仪器、明确仪器规范操作方法及注意事项，否则不得动手操作。5.使用药品时，要求明确其性质及使用方法后，据实验要求规范使用。禁止使用不明确药品或随意混合药品。6.实验中，保持安静，认真操作，仔细观察，积极思维，实验过程中必须有原始记录，不得擅自离开岗位。7.实验室公用物品（包括器材、药品等）用完后，应归放回原指定位置。实验废液、废物按要求放入指定
4、收集器皿。8.爱护公物，注意卫生，保持整洁，节约用水、电、气及器材。9.实验完毕后，要求整理、清洁实验台面，检查水、电、气源，打扫实验室卫生。10.实验记录经教师签名认可后，方可离开实验室。,实验一淀粉含量测定,一、实验目的1.掌握旋光仪的操作使用。2.了解旋光法测粗淀粉的基本原理。二、实验原理 在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶液中。在一定的水解条件下，不同谷物淀粉的比旋光度是不同的。其在171195之间，因此可用旋光法测定粗淀粉的含量。,三、实验仪器和试剂,1、主要仪器：（1）旋光仪（2）电子天平（感量0.0001g）2、试剂：1盐酸溶液 30硫酸锌溶液。15亚铁氰化钾溶液。,四
5、、实验步骤,1.样品的处理 在电子天平上称取小麦粉2.5000g置于三角瓶中加入50ml 1%HCl混成浆状（不能有结块）沸水浴中准确加热15min先加1ml 30%ZnSO4混匀再加1ml 15%亚铁氰化钾混匀移至100ml容量瓶中加水定容混匀后过滤弃去最初15ml收集其余滤液。2.旋光度测定 取滤液20ml置于旋光管中，先用1%HCl 调节旋光仪“0”点，然后将样品溶液放入旋光仪中测,六、思考题样品加盐酸处理时，煮沸时间少于或多于15min会对测定结果产生什么影响？,五、结果计算,其中：,实验二氨基酸的纸上层析,一、实验目的 通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、实验原
6、理 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。,三、仪器和试剂,1、主要仪器：（1）层析缸（2）微量进样器（3）喷雾器2、试剂：（1）展开剂：乙醇：水：冰乙酸50:10:1（2）氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸溶液及它们的混合液（3）显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。,四、实验步骤,1、平衡：将展开剂（乙醇：水：冰乙酸50:10:1）放入培养 皿中置于密闭容器
7、内使其充满展开剂（24h左右）2、点样：取滤纸1张用铅笔在距下方2cm处划线并将所得线段分成5等分从而得到4个标记点，用微量进样器分别取5l下列样品phelyspro混合Aa向4个标记点上加样（样品扩散中1cm）3、展层：将滤纸卷成筒状且不能够重叠，并用棉线扎紧然后垂直放入培养皿中进行展层2h（当展开剂沿到达滤纸长度三分之二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（a）4、显色：用0.1%茚三酮-丙酮溶液朝点样面喷雾（不要喷得太多）然后将滤纸置于电炉上方20cm处加热直至斑点出现为止，测量各斑点中心到点样点距离（b）,1计算出各种氨基酸的Rf值，并根据Rf值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱上
8、标出各氨基酸名称。2对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。,五、结果计算,六、思考题,实验三蛋白质分子量测定,一、实验目的 掌握电泳基本原理、分类、影响因素,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用途,凝胶制备。二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小。当蛋白质的分子量在15000200000之间时，电泳迁移率与
9、分子量的对数呈直线关系。,三、仪器和试剂,1主要仪器（1）电泳仪（2）电泳槽2.试剂（1）电极缓冲液（2）PH 7.2 凝胶缓冲液（3）1%TEMED，（4）30%凝胶储液，（5）10%过硫酸铵（6）0.1%考马斯亮蓝R250染色液（4）10%乙酸脱色液,四、实验步骤,1.电泳槽的安装：取两块玻璃板将带玻璃条的板（高板）放置桌面上在上面放置“U”型橡胶条最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。2.凝胶液的制备与灌装：配置20ml凝胶液：在小烧杯中依次加入5ml 30%凝胶储液，10ml PH 7.2 凝胶缓冲液，2ml 1%TEMED，2.2ml重蒸水，0.8ml 10%
10、过硫酸铵混匀立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿插上梳子放置15min，待胶凝后取下“U”条重新将胶板放置于电泳槽内向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液向内槽加入电极缓冲液没过低板最后拔出梳子。3.加样：用微量进样器加入7l标准蛋白于中间胶槽内其余槽内加入7l下列样品牛血清蛋白绿豆分离蛋白4.电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源调电流120mA电泳2h（当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）5.剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液量取指示剂迁移距离和染色剂的前胶长，然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板分离6.染色与固定：将胶板放入染色盒内向其中加入0.1%考马斯亮
11、蓝R250使其浸没置于摇床上染色过夜7.脱色：用10%乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移距离。,五、结果计算,1、计算相对迁移率：2、以相对迁移率MR为横坐标、LgMr为纵坐标，作出分子量标准曲线。3、求分子量,五、注意事项130%Acr-Bis是神经毒化合物，操作时要小心，做好个人防护2过硫酸铵需现用现配3过硫酸铵和TEMED在灌胶前加入即可4用微量加样器上样时，勿刺破胶面,根据本实验所学知识，自行设计豌豆凝集素的分离纯化实验。,六、思考题,实验四淀粉酶活力测定,一、实验目的 学习和掌握测定淀粉酶（包括-淀粉酶和-淀粉酶）活力的原理和方法。二、实验原理 淀粉酶主要包括-淀粉酶
12、和-淀粉酶两种。-淀粉酶可作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，生成麦芽糖。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。,其反应如右图：,淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于萌发后的禾谷类种子中，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在7015m
13、in钝化。根据它们的这种特性，采用加热的方法钝化-淀粉酶，测出-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再减去-淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。,三、仪器和试剂,主要仪器：（1）离心机（2）分光光度计试剂（1）标准麦芽糖溶液（2mg/mL）（2）1%3,5-二硝基水杨酸试剂（3）1%淀粉,四、操作步骤,以麦芽糖含量（mg）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。,1标准曲线的制作（每2组4人做1标准曲线）,2.淀粉酶液的制备：在电子天平上称取小麦芽（在9428冰箱内，用后放回）0.5g置于研钵中加20ml水研成浆状转移至离心管中2000转/分离心5mi
14、n（注意离心前对称放置的离心管应在天平上平衡）取上清液于100ml容量瓶中加水定容混匀即得淀粉酶原液用于-淀粉酶活力测定 吸取原液5ml于100ml容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀释液用于总酶活力测定。3.淀粉酶活力测定-淀粉酶活力测定 吸取原液1ml于具塞试管中70保温15min用于钝化-淀粉酶加1ml 1%淀粉置于40水浴中保温5min加1%3.5一二硝基水杨酸2ml 沸水加热5min后加水至20ml混匀测A1（用1#管调零）总酶活力测定 吸取稀释液1ml于具塞试管中加1ml 1%淀粉40保存5min加入1%3.5一二硝基水杨酸2ml沸水加热5min后加水至20ml混匀测A2（用1#管调零）,
15、五、结果计算,-淀粉酶活力（）淀粉酶总活力-淀粉酶活力麦芽糖含量从标准曲线上查得麦芽糖的毫克数原液体积为100稀释倍数为20规定：40度5分钟内淀粉酶水解淀粉产生1mg麦芽糖为1个活力单位（u）,六、附 注,1样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。2为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过0.5。3如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d
16、、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。,七、思考题,1为什么要将试管中的淀粉酶原液置70水浴中保温15min？2为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40水浴中保温？,实验五蛋白质含量的测定,一、实验目的 学习凯氏定氮法的原理和操作技术。二、实验原理 含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后
17、根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。,三、实验试剂、器材,1主要仪器(1)凯氏定氮蒸馏装置(2)消化炉(3)电子天平 2试剂(1)浓硫酸（化学纯）(2)硫酸钾-硫酸铜混合催化剂(3)甲基红-溴甲酚绿混合指剂(4)2%硼酸溶液(5)标准盐酸溶液（约0.01mol/L）(6)40%NaOH(7)0.01mol/L HCl,四、操作步骤,1、消化：在电子天平上称取小麦粉0.2000g-0.4000g 置于凯氏试管底部加混合混合催化剂0.5g和3ml浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（2h左右）取出放入通风橱内至不冒白烟，向其中加20ml水，并移至100ml容
18、量瓶定容即得样品消化液。同时每4组8人做1空白实验：0.5g混合催化剂+3ml浓硫酸置于凯氏试管中放入消化炉加热至淡绿色（1h左右）冷却后加水移入100ml容量瓶中定容得空白消化液。2.蒸馏与吸收：吸取10ml 2%的硼酸于三角瓶中加4d甲基红-溴甲酚绿混合指示剂（若变绿色则用0.01mol/L HCl调至紫红色）。将其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下，再吸取5ml消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用水洗两次，并加入10ml 40%NaOH后水封（注意：勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），然后打开通气阀进行加热蒸馏，直至吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏3min先移去吸收液再停止加热以防倒吸。3.滴定：用
19、0.01mol/L HCl 滴定吸收液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准盐酸的体积V1.V0。,C：标准盐酸溶液摩尔浓度(0.01)。V1：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。V0：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。W：样品重量（mg）。14.01：氮的原子量。K=5.7M=12.5%V2=100mlV3=5ml,五、结果计算,实验六 甲醛滴定测氨基氮,一、实验目的1加深对氨基酸两性解离的认识。2掌握甲醛滴定法的原理及应用。,三、实验仪器、试剂及材料,1.实验仪器：微量碱式滴定管（10ml）、2.试剂：(1)0.5酚酞指示剂：。(2)1甘氨酸即1克加100ml水配制而成(3)0.1molL
20、标准氢氧化钠溶液（使用前需标定）。(4)中性甲醛溶液：取分析纯甲醛(3637)溶液20ml，加0.5酚酞指示剂约3滴，滴加0.100molL的氢氧化钠溶液，使溶液呈微粉红色（临用前中和）。,氨基酸为两性离子，在水溶液中有下列平衡：RCHCOO-+2HCHO RCHCOO-+H+NH3+N(CH2OH)2 常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，使上述平衡右移促使NH3+释放H+，从而使溶液酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH值9.0左右），根据滴定终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出该氨基酸的含量。如果样品
21、为未知氨基酸或几种氨基酸的混合物，则只能算出其氨基氮的含量。,二、实验原理,四、操作方法,已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定:取3只三角瓶编号2ml 1%甘氨酸2ml 1%甘氨酸2ml 水（空白）均加5ml 水和5ml中性甲醛（用前加2滴 0.5%酚酞滴加0.1mol/LNaOH调至淡红色），及4滴 0.5%酚酞混匀用0.1mol/L滴至粉红色出现为止分别记下耗去标准碱的体积(V1.V2.V0）,五、结果处理与计算,式中：V：滴定样品所消耗标准碱的平均体积（ml）。V0：滴定空白所消耗标准碱的体积（ml）。C：滴定时用标准氢氧化钠的浓度（0.1molL）.14.01：lml lmolL氢氧化钠相
22、当于氮的质量（mg）。,说明：1.本法优点是简单快速，缺点是不够准确，其准确度仅达到氨基酸或氨基氮理论含量的90。而且，如果样品液中含有脯氨酸或酪氨酸时滴定误差更大，因为脯氨酸与甲醛作用后生成不稳定化合物使结果偏低，酪氨酸的酚基结构又使结果偏高。2甲醛滴定法常用以测定蛋白质的水解程度。3中性甲醛需临用前配制。放置一段时间后，在使用前需重新中和。,六、思考题,为什么说甲醛滴定法可以测定蛋白质的水解程度？除此之外还有哪些方法可以用来测定蛋白质的水解程度？,实验七酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定,一、实验目的（1）了解并掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。（2）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。
23、（3）掌握地衣酚显色法测定酵母RNA含量的原理和方法,二、实验原理,酵母含RNA达2.6710.0%，以酵母为原料使用稀碱使酵母裂解，然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA。由此得到的RNA为变性的RNA，可用作制备核苷酸的原料。用硫酸水解RNA后,可生成磷酸、戊糖和碱基,各成分用以下反应加以鉴定：（1）磷酸与钼酸铵试剂作用可生成黄色磷钼酸铵沉淀。（2）核糖与地衣酚试剂作用呈鲜绿色。（3）嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二羟甲苯（地衣酚或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催
24、化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20250微克范围内，光吸收与RNA浓度 成正比。,三、仪器和试剂,1.主要试剂（1）酵母粉（2）0.04M NaOH溶液（3）1.5M硫酸（4）无水乙醚（5）95乙醇（6）浓氨水（7）酸性乙醇溶液（8）浓硝酸（9）0.1M AgNO3（10）三氯化铁-盐酸溶液。（11）钼酸铵试剂（12）50ugRNA标准溶液,（13）苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液（14）地衣酚-铜离子试剂（15）0.001M NaOH溶液2、器材：（1）离心机（2）分光光度计（3）抽滤装置。（4）电子天平,四、实验步骤,1、酵母RNA提取称5g干酵母粉于20mL 0.0
25、4M NaOH溶液中并在研钵中研成浆状并转入三角烧瓶中。再用10mL 0.04M NaOH溶液洗涤并转入三角烧瓶中，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入 10mL酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95乙醇10 mL洗涤沉淀。再用乙醚10 mL洗涤沉淀并将沉淀转移至布氏漏斗抽滤（先称量滤纸重W1），沉淀在空气中干燥30min。称量所得RNA粗品和滤纸重W2。W2-W1即为RNA粗品重量,2、酵母RNA水解取100 mg粗提的酵母RNA于三角瓶中，加入1.5M硫酸10mL,沸水浴加热
26、10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。3、RNA组份鉴定（1）嘌呤碱：取水解液1mL于试管中滴加入40滴浓氨水。然后加入20滴0.1M硝酸银溶液，观察有无白色嘌呤碱银化合物沉淀。（2）核糖：取水解液1mL于试管中加入三氯化铁浓盐酸溶液40滴和苔黑酚乙醇溶液4滴。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。（3）磷酸：取水解液1mL于试管中加5滴浓硝酸酸化，再加入20滴钼酸铵溶液在沸水浴上加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。,4.RNA含量测定（1）标准曲线的制作：（每4组8人做1标准曲线）,以RNA微克数为横坐标，以A670为纵坐标绘制标准曲线。,（2）样品的处理：称取10mg粗提的酵母R
27、NA加入100 mL0.001M NaOH溶液混匀即得样品液.（3）酵母RNA含量测定：取试管1支加入2 mL样品液，再加2 mL地衣酚-铜试剂沸水加热25分钟冷却后测定A(用1号调零),四、结果处理1.酵母RNA得率（%）=（W2-W1）*100W 其中 W-干酵母粉重量（克）2.粗提的酵母RNA含量（%）=m*V1*100V2*W/其中 W/-酵母RNA重量（g）m-从标准曲线上查得RNA的微克数 V1-100 mL V2-2 mL,实验八赖氨酸含量测定,一、实验目的掌握谷物中赖氨酸含量的测定方法及原理。,二、实验原理,蛋白质中赖氨酸的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，
28、须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法，测定小麦种子中赖氨酸含量。谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的NH3与茚三酮试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数目成正相关，而其它氨基酸没有自由氨基，不能发生这一反应。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。,三、实验仪器、试剂,1主要仪器：（1）分光光度计（2）离心机（3）电子天平2试剂：（1）茚三酮试剂（2）2碳酸钠溶液（3）4碳酸钠溶液（4）0.1mg/ml亮氨酸溶液（5）95%乙醇,四、实验步骤
29、,1.标准曲线的制作（每2组4人做1标准曲线）,以亮氨酸的微克数为横坐标，以A515纵坐标绘制标准曲线,2、样品的处理与测定：在电子天平上称取小麦粉10mg于具塞试管底部加1ml 2%碳酸钠于80水浴中保温提取10min加2ml茚三铜试剂80水浴中保温30min后冷却至室温加5ml 95%乙醇和5ml蒸馏水充分混匀后转移至离心管中3000转/分 离心3min（离心前必须平衡）取上清液测A（以1号管调零）,五、结果计算,赖氨酸含量（%）式中：m：标准曲线上查出的亮氨酸的量(微克)；1.11=Mlys/MleuW：为样品的干重（mg）。B=0.05,实验九、凝胶层析法分离蛋白质,一、实验目的学习凝
30、胶层析法测定蛋白质分子量的原理，了解凝胶层析法的操作方法。,二、实验原理 凝胶层析又称分子筛层析，是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部而受阻滞,流速缓慢,流程长而后被洗脱；而比网孔大的分子则不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙先被洗脱(阻力小,流程短,流速大)。因此，在洗脱小分子物质后流出（洗脱体积大），从而达到分离的目的。,三、实验仪器、试剂,1.主要仪器：（1）凝胶层析仪（2）电子天平（3
31、）层析柱2.试剂：（1）Sephadex G100（2）牛血清白蛋白（3）细胞色素C（4）血红蛋白（5）核糖核酸酶,四、操作步骤 1、凝胶的选择与处理：称取凝胶干粉加过量水浸泡过夜，弃去上层细 小颗粒混匀后装柱2.装柱：将柱子垂直固定在铁架上，先向主内加入四分之一柱长水，再将凝胶倒入柱内，打开下端开口，继续灌入凝胶，直至床面距上端5cm左右，观察柱内凝胶是否均匀，有无气泡及断层出现。3.平衡：柱子装好后放置20min，用洗脱液平衡柱子直至床面不再下降为止，用蓝色葡聚糖2000检测柱子是否均匀。4.上样与洗脱：加样前检查床面是否平整，若不平衡用玻璃棒搅拌凝胶使其自然下沉，在胶面上放置圆形滤纸片防
32、止加样时冲击床面，用胶头滴管吸去上层多余水，然后慢慢滴加10d牛血清蛋白样品（每组8人加1次样，两次加样间隔20min），待样品进入凝胶后，向床面滴加2cm高度水防止干胶，拧紧螺丝；打开恒流泵，紫外检测仪，记录仪及部分收集记下初始笔尖位置，直至峰值出现记录笔移动距离L。5、仪器参数设置及调整：紫外检测仪：当档位置于100%T时，调光量至数显为100。当档位置于0.5A时 调A数显为0 记录仪：设置纸速2cm/h 部分收集器：设置每10min收集1管，调恒流泵流速使每管收集液体为4ml 即v=0.4ml/min,五、结果计算,1、以管号（或洗脱液体积）为横坐标、相应管的A280为纵坐标，绘制洗脱
33、曲线。2、根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积Ve，然后以蛋白质分子量的对数值（logMr）为横坐标、Ve为纵坐标，作出分子量标准曲线。3、样品完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外检测获得的洗脱体积，从分子量标准曲线查出相应的分子量。注意事项：1.层析柱上方要留有少量液体，避免使凝胶暴露于空气中2.凝胶过滤上样时，使样品沿管壁缓缓流下，勿冲破胶面,实验十：酵母蔗糖酶的提取及部分纯化,一、实验目的：学习酶的提取和纯化方法，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。二、实验原理：蔗糖酶（invertase）（-D-呋喃果糖苷果糖水解（fructofuranoside fructohydrolase）（EC
34、.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量
35、也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。,三、试剂与器材：1.试剂：（1）啤酒酵母（2）甲苯（使用前预冷到0以下）（3）1N乙酸（4）95%乙醇（预冷至20）(5)0.02MPH4.9乙酸缓冲液(6)预冷蒸馏水2.器材：（1）研钵1个（2）恒温水浴（3）广泛pH试纸（4）高速冷冻离心机,四、操作步骤：1.提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中（两组做一个）。（2）取5g二氧化硅放入研钵中研细。（
36、3）称取5g干啤酒酵母放入研钵中，量取预冷的甲苯20mL缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需30分钟，至酵母细胞大部分研碎。（4）缓慢加入预冷的30mL去离子水，每次加2mL左右，边加边研磨30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。（5）将混合物转入4个离心管中（每组2个），平衡后，用高速冷冻离心机离心（4，10,000rpm，10min）。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，两组平衡后，4，10,000rpm，离心10min。（7）将清液转入量筒，量出体积（“粗级分I”），取出1.5mL放入小离心管中，
37、冷冻保存，备下次实验测定酶活力及蛋白质含量。其余部分转入另一清洁离心管中。2.热处理（1）预先将恒温水浴调到50，（2）用广泛pH试纸检查清液（“粗级分I”）的pH，用1N乙酸将pH调至5.0。（3）将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。（4）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，平衡后4，10,000rpm，离心10min。（5）将上清液转入量筒，量出体积（称为“热级分II”）。取出1.5mL放入小离心管中，冷冻保存。3.乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴中，逐滴加入等体积预冷至20的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，以沉淀完全。于4，
38、10,000rpm，离心10min，倾去上清，并滴干。用3mL，0.02mol/L，pH4.9乙酸缓冲液将沉淀溶解，平均分成两份（称为“醇级分”），冷冻保存。,实验十一:蔗糖酶活力的测定,一、实验目的 掌握蔗糖酶活性测定方法。了解各级分酶的纯化情况。二、实验原理为了评价酶的纯化效果，必须测定各级分酶的活性和比活性。测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelsons试剂法、水杨酸试剂法等，本实验使用费林试剂法。其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成
39、蓝色溶液，其蓝色深度与还原糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。,三、试剂和器材（一）试剂：1.碱性铜试剂：称10g无水NaCO3，加入100mL去离子水溶解，另称1.88g酒石酸，用100mL去离子水溶解，混合二溶液，再加入1.13克结晶CuSO4，溶解后定容到250mL。2.磷钼酸试剂：在烧杯内加入钼酸17.5g，钨酸钠2.5g，10%NaOH 100mL,去离子水100mL，混合后煮沸约30min（小心不要蒸干），驱去钼酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加85%磷酸63mL,混合并稀释到250mL。3.0.25%苯甲酸200mL，配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替。
40、4.葡萄糖标准溶液：（1）贮液：精确称取无水葡萄糖（应在105恒重过）0.1802克，以0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到100mL容量瓶中（浓度10mmol/L）。（2）操作溶液：用移液管取贮液10mL，置于50mL容量瓶中，以用0.25%苯甲酸或去离子水稀释至刻度（浓度为2mmol/L）。5.0.2mol/L蔗糖溶液50mL，分装后冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一管化冻后摇匀。6.0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9，200mL。（二）器材：1.试管20支，试管架1个 2.秒表1块，或用手表。3.移液管：0.1、0.2、2.0、5.0mL 4.水浴锅 5.电炉 6.橡皮筋 7.保鲜膜
41、,四、操作方法 级分、酶活力的测定：1.用蒸馏水稀释各级分酶液（约5,000倍。根据纯化后酶活力大小可在实验十二稀释液的基础上进一步稀释）。2.按下页“表1”的顺序在试管中加入各试剂（mL），进行测定。,表 1 级分、II、III的酶活力测定,五、结果计算1.稀释后酶液的活力（按还原糖计算）：式中：A650：第210管所测A650 A650：第12管所测A650 0.2：第12管葡萄糖取样量 2：标准葡萄糖浓度（2mmol/L=2mol/mL）10：反应10min B：每管加入酶液的毫升数。2.原始酶液的酶活力 E=(平均E/2)稀释倍数（Units/mL原始组分）注：一个酶活力单位Units
42、，是在给定的实验条件下，每分钟能催化1mole蔗糖水解所需的酶量，而水解1mole蔗糖则生成2moles还原糖，计算时请注意。3.酶纯化效果分析：,注：蛋白含量=蛋白浓度校正体积 总酶活=酶活稀释倍数 比活力=总酶活/总蛋白含量 纯化倍数=比活力之比 回收率=总酶活之比 为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响。,表2 酶的纯化表,表3 记录体积的校正,实验十二 Bradford法测定蛋白质含量,一、实验目的 了解各种蛋白质含量测定方法的优缺点，掌握Bradfor
43、d法测定蛋白质含量的原理及方法。二、原理考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max）由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g/mL。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。（3）干扰物质少。,三、试剂与器材 1.试剂：（1）0.1mg/mL牛血清白蛋白溶液（2）染料试剂：0.1mgmL 考马斯亮兰G-250 2.器材：（1）可见光分光光度计（2）离心机,（3）加完试剂后混匀。5分钟后，以一号管为空白测定各管的A595。（4）用标准蛋白含量为横坐标，用吸光度值A595为纵坐标作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.05mg牛血清蛋白/mL溶液的A595约为0.29。,四、操作方法（1）取级分I、级分II、级分III各0.2mL，分别用蒸馏水稀释50倍。（2）取13支试管，按下表编号并添加各种试剂（mL）。,
