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1、第二章 沉 淀 法,沉淀法是分离纯化生命大分子物质常用的一种经典方法；其特点是：操作简单，成本低廉 常见的方法有盐析、有机溶剂沉淀、蛋白质沉淀、PEG沉淀、选择性沉淀、结晶沉淀等,掌握沉淀法的基本原理及影响因素掌握沉淀类型及其在制备蛋白质、核酸中作用原理熟悉沉淀法在制备蛋白质和核酸过程中的实际运用,目 的,第一节 基本原理与沉淀类型,一、基本原理,根据同一溶剂中有效成分与杂质溶解度差异。选用某种溶液系统，使所需有效成分出现最大溶解度，而杂质出现最小溶解度；或者相反，然后溶解度小者以沉淀的形式析出，达到有效成分与杂质分离的目的,根据蛋白质和核酸在组成、结构及性质等方面的明显差异，所以从生物材料中
2、提取制备这两类物质，一般选用的试剂和操作方法也不完全相同,二、制备蛋白质,（一）盐析法,1.原理,蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的增高而上升（盐溶）；但当盐浓度增加到一定数值时，其溶解度有随盐浓度逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）,盐析的内因是当盐浓度达到一定程度时，水的活度降低，导致蛋白质分子表面电荷中和，水化膜相继破坏，蛋白质分子聚集而析出沉淀,2.基本步骤,选择一定浓度的盐溶液，使部分杂质“盐析”，有效成分“盐溶”（025%的（NH4）2SO4）离心分离上清再调一定浓度盐（2560%饱和盐溶液），使有效成分“盐析”离心收集沉淀物，即为初步纯化的有效成分,（1）盐分级沉淀,盐的选择：在蛋
3、白质盐析时，常选用的盐是（NH4）2SO4,（NH4）2SO4的优点：溶解度大；对温度不敏感；分离效果好（如有时一次可除去75%的杂蛋白）；（NH4）2SO4本身有稳定蛋白质结构的作用；价格低廉；废液还可作肥料缺点：与其他盐一样，若需进一步纯化，需脱盐处理,（NH4）2SO4盐析,固体法,在大体积的粗提液中逐渐加入固体（NH4）2SO4，边加边搅拌，缓缓加入。在此过程中，溶液（NH4）2SO4的浓度不断升高，水分子不断与（NH4）2SO4结合，当加入的（NH4）2SO4达到盐析点时，蛋白质就会沉淀出来,例：在尿素酶抽提液中加入（NH4）2SO4，当饱和度达为35%时，尿素酶基本留在溶液中；但当
4、饱和度达到55%时，尿素酶几乎全部沉淀 至于蛋白质溶液中加多少（NH4）2SO4使其饱和度符合蛋白质盐析，可查表2-2，或用下列公式计算：,（20）,（25）,表示一升溶液中需加入的（NH4）2SO4的克数,硫 酸 铵 对 尿 素 酶 的 沉 淀 作 用,调 整 硫 酸 铵 溶 液 饱 和 度 计 算 表,饱和溶液法,在pro溶液中加入预先调好的饱和（NH4）2SO4溶液，不同的饱和度所需的（NH4）2SO4的量用下式计算：,表示需加入（NH4）2SO4溶液的体积（ml）,表示原来溶液的体积,表示始、终盐的饱和度,表示需加入（NH4）2SO4溶液的饱和度,此法较固体法温和，但不宜用于大体积样品
5、；否则引起样品液体积增加，计算不准确。不能达到预期的目的,透吸法,将装有pro溶液的透吸袋放入一定浓度大体积盐溶液中，利用半透膜透吸改变pro溶液中的盐浓度 由于此法的盐浓度是以连续状态变化的，可避免局部盐浓度过高而产生的不良影响；所以分离效果好 但透吸袋体积有限，盐析速度缓慢，（NH4）2SO4消耗多等原因，致使此法仅用于要求较精确、样品体积小的试验过程中，难于放大,（2）制作盐析曲线,用盐析法沉淀分离pro样品是，（NH4）2SO4的“盐析”浓度很关键，所需的浓度范围要通过具体试验确定：取一定体积已测含量的pro或酶的待分离溶液，调pH至稳定范围分610次加入不同量的（NH4）2SO4至出
6、现浑浊时，分离上清；如此反复610次，分别收集每次的沉淀根据每次沉淀的pro或酶的量和相应的（NH4）2SO4浓度之间作图，即得盐析曲线（如图2-1）参照表2-3的分级试验方法，再根据所用生物材料来源的难易程度，以及对有效成分纯度和得率的要求，先找出有利于提高纯化倍数或得率的大致框架，然后经过反复试验就能确定最佳盐析范围（即（NH4）2SO4 的浓度范围）但若生物材料来源容易，主要考虑提高纯化倍数，得率高低可视为次要因数，若材料来源困难，则主要考虑得率,典 型 盐 析 曲 线,由表可知，若生物材料来源容易，主要是考虑提高纯化倍数时，选择48%65%盐饱和分级范围，酶的纯化倍数可达3.0，而得率
7、仅为75%；若生物材料来源较困难，主要是考虑提高收得率时，则选择45%70%甚至45%75%盐饱和分级范围，酶的收得率可达80%以上，而纯化倍数将2.4,（3）影响盐析的因素,盐析常数（Ks）,每种pro在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度之间存在如下关系 S表示有效成分在水中的溶解度;M表示摩尔浓度;Ks表示有效成分在特定条件下的恒定值,Ks值越大,则意味着有效成分溶解度降低的速度随着盐浓度的增加而快速降低;因此,对一种有效成分而言,Ks值越大，分级范围就越窄，盐析效果就越好。Ks还受pro本身的性质、溶液的pH、温度及盐的种类等因素的影响,在pH7.0溶液中几种蛋白质的和KS常数（溶解度S以m
8、g/ml表示）,盐分级范围的差异性,在pro分离过程中，若每一种pro的Ks都很大，分离效果不一定好。因为盐析效果还与盐析范围的差异性有关各pro的Ks大+盐析范围差异明显，则分离效果好；如图2-2中AC各pro的Ks大+盐析范围差异较小，则分离效果不好；如图2-2中AB,pH和盐浓度,有效成分的溶解度会受到pH和盐浓度的显著影响例：兔肌磷酸甘油醛脱氢酶（pI约8.5）可溶于pH6.0，3.2mmol/L的（NH4）SO4溶液中，但若调节pH.，则立即产生沉淀这说明选择适当pH的盐溶液可提高盐析的效果,一般来说，在分级盐析过程中，第一次盐析时（除去杂质），pH应偏离有效成分的pI值，而接近杂质
9、的pI值；而在第二次盐析时（沉淀有效成分），pH应调节至接近有效成分的pI值,蛋白质的纯度和浓度,蛋白质存在的形式（均一的还是混合的）和浓度不同，盐析范围和溶解度也不一样。在混合的pro溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀作用。Pro浓度越高，这种现象越明显，盐析分离效果则越差；因此，一般控制样品液Pro浓度在0.22%之间为宜,其他,在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加1mmol/L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带入的金属离子。另外，加（NH4）2SO4沉淀的时间要控制好，过长或过短都不宜，一般控制在2h左右,（4）脱盐,常用方法：凝胶过滤法和透析法,透析操作的注意事项：透析袋处理：
10、市售透析袋要D.W洗净，检查无漏洞时再用。若用来去除某些易被金属离子或水解酶破坏的样品中的盐时，透析袋应用含EDTA-Na2的NaHCO3溶液中煮沸10min；并经D.W煮沸、漂洗后再用透析液的选择：透析液一般为低离子强度的中性缓冲液。对含有辅基的酶透析时，宜在透析液中加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为防止微生物的生长，透析应在4进行或在透析液中添加0.02%的NaN3,(二)有机溶剂沉淀法,1.原理,与盐溶液一样具有脱水作用，使Pro表面的水化膜破坏降低溶剂系统的介电常数，即降低极性（而蛋白质为水溶性物质）,2.常用有机溶剂：MeOH、EtOH、Me2CO等3.有机溶剂的使用量：,V表示加入
11、有机溶剂的体积；V0表示蛋白溶液的原始体积S1表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度)S2表示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度(体积百分浓度)C表示有机溶剂的浓度（如无水EtOH，则C=100，95%EtOH，则C=95）,4.注意事项：,中性盐作用。即在有机溶剂沉淀时，加入适量中性盐，一方面可增加Pro在有机溶剂中的溶解度，另一方面可防止Pro变性（0.05）；提高分级效果低温下操作。因为有机溶剂加入水溶剂中会放热，若不注意降温，容易导致Pro变性多价阳离子作用。有些Pro能和多价阳离子（如Zn+、Cu+等）结合形成复合物，致使Pro在有机溶剂中溶解度降低，这对在高浓度溶剂中才能沉淀的Pr
12、o特别有益。如在某些Pro溶液中加入0.0050.02mmol/L的Zn+，就可节省大量有机溶剂，使Pro有效得沉淀出来,（三）蛋白质沉淀法,1.碱性蛋白质（多价阳离子的碱性蛋白质）,如：鱼精蛋白，既能有效得沉淀核酸，又能沉淀Pro应用：鱼精蛋白加入到部分纯化的酵母PFK溶液时，溶液中的酶蛋白便会吸附到鱼精蛋白核酸沉淀物上；将沉淀物用0.1mol/L磷酸缓冲液洗脱，收集的PFK纯度提高了9倍 从深红螺菌中分离PEP羟基激酶时，加鱼精蛋白处理，可除去其中3/4的杂蛋白，而酶蛋白仍然保留在溶液中缺点：多价阳离子的碱性蛋白质不可再利用，且其水溶液pH23，要小心调中性后才能应用,2.凝集素,目前研究
13、得比较清楚的是植物血球凝集素，如伴刀豆蛋白，它是一种特殊的蛋白质，主要对糖蛋白糖链末端序列有特异、明显的凝集力例：伴刀豆蛋白对含有G、甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异凝集沉淀作用，通过离心可把糖蛋白与一般蛋白质分离开，获得的凝集素-糖蛋白复合物用单糖作抑制剂即可解离优点：条件温和，专一性强,3.重金属,重金属（Pb2+、Hg2+）也能与蛋白质沉淀，纯化Pro。但由于重金属易使Pro变性，故应用时要控制在较温和的条件下进行，并及时除去重金属,(四)PEG沉淀法,此法应用较广,属于非离子型聚合物引起的Pro沉淀作用;沉淀条件温和，不易引起Pro变性，且沉淀较完全 如用20%PEG-6000或57%P
14、EG-400可使-葡萄糖苷酶80%发生沉淀,（五）选择性沉淀,利用目的Pro与杂Pro在不同物理化学环境下的稳定性不同（如温度、酸碱度、有机溶剂等），用选择性沉淀法，使杂Pro变性沉淀，而目的Pro存在于溶液中或发生可逆性沉淀，从而使目的Pro得到纯化,例：酵母干粉抽提液升温至55，20min后迅速冷却，离心除去热变性的Pro，上清液中为对热稳定的醇脱氢酶 假单胞菌培养液中加 HCl 调pH至4.0，得到碱性脂酶的沉淀,（六）结晶沉淀法,操作：,将欲结晶的物质溶解于适当溶剂中，加入适量的盐（如2040%（NH4）2SO4）或有机溶剂（如EtOH、MeOH等），使其溶解度降低至接近饱和的临界浓度
15、或刚刚开始出现沉淀调节pH至等电点附近，控制温度4左右，使溶解度进一步降低放置一段时间（陈化），即可得到结晶沉淀,对于难结晶的物质，有时采用加入少量“晶种”引子，或进行适当搅拌，或在容器 壁上用玻棒磨檫等方法，可加速结晶,三、制备核酸,从生物材料（如动物组织、线粒体、叶绿体，以及微生物中的真菌、细菌和病毒等）中分离出的DNA或RNA，往往是以DNA-Pro（DNP）或RNA-Pro（RNP）复合物的形式存在的，所以制备核酸样品时，首先需使复合物解聚，释放出核酸，除去Pro，然后用沉淀法得到核酸,（一）DNP/RNP复合物的解聚,在破细胞溶液中，加入适量的阴离子去污剂SDS或十二烷基肌氨酸钠、脱
16、氧胆酸钠DOC、聚氧乙基十六烷基酚醚、TWeen等，使DNP/RNP解聚释放出核酸加入适量醋酸钾溶液沉淀SDS-pro和SDS-K+等，然后离心除去沉淀分离上清，即为初步纯化的核酸制品,1.加去污剂,2.加有机溶剂,用有机溶剂反复处理抽提液，直至处理液经离心后，水相-有机相界面交接出无变性的pro为止 注意有机溶剂的祛除一般用乙醚提取，再在低温蒸馏除净乙醚,3.蛋白酶处理,用蛋白水解酶除去复合物中的pro组分，此法条件温和，一般不会造成对核酸的破坏 常用的pro水解酶有：溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E等,（二）消除多糖等杂质,1.多糖,抽提前用“饥饿法”可减少生物材料中贮存多糖（如淀粉、糖原等）的
17、含量 混杂于核酸提取液中的多糖类杂质，一般用异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，适用于酸性多糖）等选择性沉淀剂除去；此外，也可用等体积2.5mol/L磷酸缓冲液和等体积乙二醇甲醚处理，经离心，多糖位于中部，核酸位于上层乙二醇甲醚中,2.DNA与RNA的分离,盐析法 DNA：易溶于12mol/LNaCl溶液，难溶于0.14 mol/LNaCl溶液原理 RNA：易溶于0.14 mol/LNaCl溶液，难溶于12mol/LNaCl溶液例：从小牛胸腺提取DNA：用0.14 mol/LNaCl溶液反复洗涤、绞碎、离心；结果RNA存在于溶液，DNA存在于沉淀中酶水解法在提取DNA时，用RNase水解R
18、NA，RNase中混有的DNase用100热 处理15min在提取RNA时，用DNase水解DNA，DNase中混有的RNase，在Ca2+存在条件下，加蛋白酶K作用或加碘乙酸钠处理，使RNase破坏,（三）核酸沉淀,在核酸溶液中加入某些有机溶剂或非离子型聚合物试剂时，核酸会被有效地沉淀,1.有机溶剂沉淀法,乙醇盐溶液操作：在核酸溶液（0.1l/ml）中加入0.1mol/L NaCl 和2倍量体积（DNA）或2.5倍体积（RNA）的冷无水乙醇，就可将核酸沉淀出来注意：沉淀时间与温度、核酸分子大小、浓度有关,DNA1kb时，室温数分钟，高速离心即可（16000rpm15min）DNA1kb时，-
19、70数小时十几小时，高速离心即可DNA 200bp时，加有机溶剂前需加入0.01mol/L的MgCl2，促进沉淀,异丙醇操作：在含有DNA的溶液中，加入0.3mol/L的NaAC和0.541倍体积 的异丙醇，短时间放置后离心，得到核酸沉淀核酸沉淀的形状与其分子量密切相关：M106Da的双链DNA呈丝状纤维样；小分子量的双链DNA呈凝胶状缺点：异丙醇沸点高，不易从核酸中除去，且蔗糖、NaCl等易和DNA共沉淀,2.PEG沉淀法,加PEG-0.5mol/L NaCl溶液到核酸溶液中，可使2kb的DNA片段沉淀。沉淀时，PEG的浓度与DNA片段的分子量成反比：DNA1.65kb时，用5%PEG沉淀 DNA=1.2kb时，用6%PEG沉淀 DNA=0.6kb时，用7%PEG沉淀 得到的沉淀溶于0.2mol/L NaCl溶液中，用EtOH沉淀核酸或用CHCl3抽提除去 PEG，即可得到纯核酸制品,3.CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法,此法适用于含大量多糖杂质的核酸样品的纯化操作：向溶液中加入1%CTAB和0.35 mol/L NaCl，可得到CTA-核酸沉淀，多糖仍存在于溶液中；随后用0.1 mol/L NaAC 70%EtOH 洗涤，CTA+从 沉淀物中置换出来，和乙酸生成可溶性的十六烷基三甲基乙酸铵，而核酸形成钠盐，在70%EtOH环境 中仍以沉淀存在,第二节 实例应用,
