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1、基因表达检测,第三部分：,RT-PCR(Reverse transcription PCR),Reverse Transcription PCR,RNA抽提,cDNA,反转录,基因特异性引导Oligo(dT)引导随机六核苷酸引物引导,PCR,Northern Blotting,基因表达分析,Northern Blotting,Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993.,基因表达水平,（梁大成等，2006）,表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析,（周斌，2001，硕士论文）,mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT
2、-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。,实验原理,被污染的试剂，缓冲液移液器使用的器皿及tip等操作者的手，头发等,RNA操作中应注意的问题：防止RNase污染,外源RNase的主要来源：,当处理RNA时，移液器专用保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用；溶液和试剂分装成小份保存；RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗）；,防止外源RNase污染的主要措施(一）：,准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品使用专用药勺或直
3、接敲击瓶底分离，可能的话，用0.1的DEPC在37C处理溶液1小时后在15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。180300C烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品；使用新的、无RNA酶的一次性tubes,tips等；在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。,防止外源RNase污染的主要措施(二）：,材料要新鲜;裂解过程要同RNase活性抑制同步,防止内源RNA酶降解RNA,RNA酶抑制剂,RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：,DEPC氧钒核糖
4、核苷复合物 RNA酶的蛋白质抑制剂,DEPC:,是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧基甲酸化形式破坏RNase的活性,氧钒核糖核苷复合物:,能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性,RNA酶蛋白质抑制剂Ribonuclease Inhibitor,可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。,RNA EXTRACTION(mini prep),RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Northern blot,RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实
5、验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。,实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量 实验材料：水稻幼嫩叶片,苯酚/氯仿反复抽提，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可 配合氯化铯离心或有机溶剂提取。Trizol Reagent,提取方法：,利用Trizol 试剂 抽提植物总RNA,Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA
6、处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。,75乙醇（in DEPC-treated water)氯仿异丙醇（RNA专用）RNase-free water：Draw water to RNase-free glass bottles.Add diethylpyrocarbonate（DEPC）to 0.1%.Let stand overnight and autoclave.防止外源RNase的污染：应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180C烘烤3hrs以上；塑料制
7、品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一次性用品如tube,tip等使用新的，无RNA酶的产品。,RNA抽提前应准备的其它试剂及物品：,操作步骤（一）,液氮磨样，每管分装0.1克样品；每管加1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积的10），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置510分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；加200 l的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右；,4.2-8，12000g 离心10-15分钟；将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室温下沉淀10分钟；2-8，12000g 离心15分钟；弃上清，加1ml 75乙醇
8、清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500g 离心5分钟，小心弃上清；室温静置515分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 l DEPC水溶解，保存于-70。取2 l 琼脂糖电泳检测RNA质量。,操作步骤（二）,RNA的琼脂糖凝胶电泳,用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进行琼脂糖凝胶电泳用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在含6或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳检测 0.5TBE,In 1 MOPS80 150V 40 min 1h30min,电泳,有溴化乙锭存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由tRNA，5
9、.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊的迁移较快的带。如果RNA没有降解，28S rRNA的亮度应当是18S rRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。,What does good or bad total RNA look like when separated in gel?,Callus,Leaf,Degradation,Contaminant,Good,RNA产量低的原因,样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底RNA没有完全溶解,RNA降解的主要原因,取样后没有立即抽提RNA；抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围；样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入-70，而不是-
10、20）使用的溶液或器皿有RNase污染琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5,DNA污染的原因,样品太多，所加试剂相对太少用来分离RNA的样品中含有机溶剂（乙醇，DMSO等），或碱溶液等,RT-PCR(Reverse transcription PCR),实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程实验材料：水稻幼嫩叶片RNA,目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能直接扩增。mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上
11、检测基因时空表达的常用方法。,实验原理,DNase I:是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生成具有5P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。Mg2+存在时，能在双链上产生切口；而Mn2+存在下能将双链DNA同时切断，使DNA片断化。活性定义：以小牛胸腺DNA为底物，在25C、pH5.0的条件下，1分钟内使反应液的260nm吸光度增加0.001所需要的酶量定义为1个活性单位。,用途：与DNA Polymerase I一起用于切口平移体外转录后除去模板DNAMn 2+存在下为鸟枪法测序（shot gun sequencing)制作 DNA文库 用于足迹法（foot printing)分析 DNA
12、-蛋白质相互作用,单链多肽，具有聚合酶和较弱的RNase H活性（或RNase H），最适反应条件：37 C,pH8.3,反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶,鼠白血病毒反转录酶 M-MLV：,禽成髓细胞反转录酶 AMV,2条多肽链，具有聚合酶活性和较强的RNase H活性，最适反应条件41-45 C，pH8.3比pH7.6活性高,RNase H：催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的降解，产生不同链长带3羟基和5磷酸末端的寡核苷酸。,Ribonuclease Inhibitor,单一多肽，可与RNaseA形成1：1非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用
13、。活性表达需要巯基化试剂（DTT）,本实验以水稻叶片RNA为材料，检测转基因水稻gus基因的表达。实验中设置一个看家基因作为阳性对照，判断RNA 的定量及反转录、PCR等过程是否有问题；设置一个不加模板RNA的阴性对照，主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性；PCR 时设置一个以叶片DNA为模板的阳性对照，检验扩增带型是否来源于反转录的cDNA,实验设计,操作步骤（一）RNA Preparation,Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent.Dilute the Total RNA to the final concentration o
14、f 1 g/l by DU640.Combine the following in a 0.5 ml sterile eppendorf tube:Total RNA 3l(2-5g)RNase-free DNase l(u/l)10 DNase buffer 1 l add DEPC-treated ddH2O 5 lIncubate at 37 for 15 min,then 70 for 10 min.,操作步骤（二）Reverse Transcriptase Reaction,Add 1 l 500 g/ml oligo(dT)15 primer,mix the contents of
15、 the tube by gently vortexing and collect the reaction by brief centrifugation.Heat the mixture at 70 dry bath for 10 minutes,then put on ice for 5 minutes.Add the following contents:5 first strand buffer4 lRRI1 l 10 mM dNTP 1 l M-MLV(200 U/l)1 l DEPC H2O 2 l,操作步骤（二）,4.incubate at 37 for 1 h.(The to
16、tal volume should now be 20 l)5.Inactive the reaction by heating at 70 for 15 min,then add 20 l ddH2O and the first strand of cDNA can be used as a template to amplification in PCR.6.To remove the RNA complementary to the cDNA,add 1 l(2 units)of RNase H and incubate at 37 for 20 min.,PCR技术,PCR（多聚酶链式
17、反应是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性（denaturation，）退火（annealing）、延伸（extension）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。,The Invention of PCR,Invented by Kary Mullis in 1983.First published account appeared in 1985.Awarded Nobel Prize for Che
18、mistry in 1993.,模板DNA：一般102105个拷贝Mg2：Mg2能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中1.5-2.5 mmol/L 反应反冲液：使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。dNTP：在PCR反应体系中其浓度一般为 20200 mol/L，浓度过高、过低都不利。Taq DNA聚合酶：在7075C具最高活性。具有53的聚合酶活性和53的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。引物：PCR反应中引物浓度一般为0.10.5 mol/L。,PCR反应体系中的主要成分及其作用：,变性：模板DNA由双链变成单链，使有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和
19、时间，一般情况下94C 30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性（过高的温度或高温持续时间过长，可对Taq DNA聚合酶活性和dNTP分子造成损害）。退火：变性的DNA快速冷却至4060C可使引物和模板DNA发生结合。可根据引物的长度和GC的含量选择复性温度。退火时间30秒。延伸：一般是7075C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。1kb的可适当延长时间。循环次数：理论上2025个循环PCR产物的累计即可达到最大值、实际操作中2530较合理。循环次数越多，非特异性产物的量也会增加。,循环条件的设定：,Thermal Cyclers,PCR machine available from many
20、suppliers.Many block formats and multi-block systems.Reactions in tubes or 96-well micro-titre plates.,在冰上配制下列反应体系:First strand cDNA 2 lTaKaRa Ex Taq(5 u/1 l)0.5 l10 Ex Taq buffer2 ldNTP mixture(2 mM)2 lPrimer F(10 mM)0.5 lPrimer R(10 mM)0.5 l ddH2O12.5 l 混匀后，短暂离心，每管加一滴矿物油。,操作步骤（三）PCR,PCR反应循环条件设置：根据
21、引物及基因的表达水平设置循环参数：如引物序列、引物长度、扩增片段的长度及mRNA 的丰度等,检测：加2 l溴酚蓝，混匀，取15 l反应产物电泳；在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。,引物序列,反应程序：94度 45秒，58度 45秒，72度 60秒，27 CYCLES.Genome:750 bpcDNA:250 bp,2KB cDNA ZH11 H2O,-actin,本次RT-PCR实验使用的引物：报告基因：GUS组成型基因：GAPDH,Taq酶过多；Mg2+浓度不合适；引物浓度过高或设计不合理；复性温度过低；循环次数过多；模板量过多；,PCR产物的电泳检测时出现拖带或非特异性扩
22、增带的可能原因：,PCR扩增产物电泳检测,Optimising the Annealing Temperature,Primers have a calculated annealing temperature(e.g.54).Temperature must be confirmed practically.Temperature steps of 2 above and below.Use gradient cycler.,Optimising the Mg2+Concentration,The fidelity of the PCR depends on Mg2+.Optimize Mg
23、2+in a ladder of 0.5 mM.Sometimes a compromise between yield and specificity.,引物问题,引物浓度过高：与模板错配，非特异扩增；产生引物二聚体引物长度：一般1828 bp；GC含量约5060配对引物的Tm值要相当引物3端应尽量避免互补，以免产生引物二聚体引物3端3个或3个以上的GC，容易结合到基因组GC丰富区域，导致错误扩增,点样或染胶问题反应体系中忘记加入某种成分(无扩增产物）或分装mixture时出了问题；目的片段太大，使用的DNA Polymerase 无法扩增出目的片段；DNA溶液中或反应体系中含有Taq 酶抑制剂，抑制了Taq DNA聚合酶的活性。退火温度太高；Taq 酶活力不够或其他试剂有问题；引物设计不合理，与模板不配对等。,导致PCR产物很少或无扩增产物的原因,凝胶电泳检测PCR产物时，目的扩增带很弱或看不到目的扩增带，应从以下几个方面寻找原因：,
