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1、生物工程下游技术,第二章 细胞分离与破碎3 学时,学习目的和要求,掌握解细胞分离和目标产物的释放的原理和方法，熟知各种方法的优缺点和应用范围。,目录,一、细胞分离（一）、重力沉降（二）、离心沉降（三）、过滤二、细胞破碎与胞内物释放,细胞分离学习要点,识记：重力沉降、离心沉降和过滤的概念。理解：重力沉降、离心分离与过滤原理、理论；掌握Stokes（斯托克斯）沉降公式。应用：常用离心方法及优缺点；利用掌握的提高分离效率的方法分析决实际问题,（一）、重力沉淀,1、重力沉淀的定义2、重力沉淀的理论3、提高重力沉降的途径,1、重力沉降定义,重力沉降是传统化工过程中常用的从含有固体颗粒的流体中将颗粒分离出
2、来的操作。重力沉降是利用流体与颗粒间的密度差，在重力的作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现两者的分离。在生物分离过程中，定义中颗粒为细胞、细胞碎片等有形物,千姿百态的微生物世界,Bacterial morphology diagram,High-density cell culture,2、重力沉降理论,理论假设细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理；颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降，颗粒之间无相互干扰 受力分析 球形颗粒重力fg 液体的浮力fb 颗粒运动方向相反的阻力 fs,F,b,F,g,Fs,d=2R,球形颗粒沉降的受力情况,重力沉降理论,重力：,浮力：,阻力：,d,Ps分别指颗粒的直径（
3、m）和密度（kg.m-3）,重力沉降理论,当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力达到平衡时，,则,重力沉降理论,当球形颗粒处于滞流区（）时,当球形颗粒处于过渡区（）时,当球形颗粒处于湍流区（）时,千姿百态的微生物世界,Bacterial morphology diagram,High-density cell culture,球形颗粒？,无限稀释溶液？,3、提高重力沉降的途径,加入中性盐：双电层排斥电位降低加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝图引入外力,（二）、离心沉淀,1、离心沉淀的定义2、离心沉淀的理论3、离心分离方法4、离心分离设备,1、离心沉降定义,离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒
4、旋转，在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。,2、离心沉降理论,离心沉降速度,令：,3、离心分离方法,差速离心分级区带离心 差速区带离心 平衡区带离心,差速离心分离,差速离心是以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离方法，应用某一特定颗粒沉淀的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒沉淀及包含未沉淀颗粒的上清液。,差速离心分离应用实例,600g,10 min,15000g,10 min,100000g,60 min,300000g,120 min,nuclei,Mitochondrialysosomes,Plasma membra
5、ne,Riosomal subunits,homogenate,Filtered homogenate,Soluble part of cytoplasm,Sedimentation,区带离心分离前提,在离心管内的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同浓度（密度）的梯度介质（蔗糖等），按照浓度从大到小的原则，依次层层加入。加入离心管中的梯度介质经高速离心或静置后可形成连续的密度梯度。,操作过程,区带离心种类,差速区带离心(速度区带离心）平衡区带离心（等密度离心）,差速区带离心,差速区带离心,基于颗粒的大小、形状的分离梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度
6、与梯度液密度相等动态离心分离方法,平衡区带离心,平衡区带离心,梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等平衡离心分离方法,梯度液的种类和应用,细胞分离区带离心异同,离心方法新进展具体表现在哪几个方面？,1.固定角转子垂直管离心法的进展使用垂直管转子的成功之例是1980年由B.H.Chung等提高的血清脂蛋r白分离的SVs方法(即Single Vertical Spin法,一单次垂直管离心法)，它使对临床诊断意义很大的这一分离在实用上成为可能.传统的血清脂蛋白分离用“顺序浮选法”(即SF法)，一次分离需时3天，用去驱动寿命1亿转以上。现用垂直管转子作
7、SVS方法，不连续NaCI/KBr或NaCI/Sucrose梯度，5.5万一6.5万转/分，0.75-2.5 i)时，一次分离成功。,3.短液柱离心法(Short-Column method)由美国的0.M.Griffith在1978年提出。短柱法是在角式或水平转子中人为地使用不加满的离心管来降低液柱高。此法不仅降低液柱高以减少离心时间，更重要的是使处千液面的样品受到更大的离心力从而进一步缩短了离心时间，在不减少样品量和样品浓度的条件下，可把离心时间缩短为常规满管离心时的一半或更少。短液柱法使用中厚PC管和厚壁PA管，它们在不加满离心时也不会变形。,4.细绝(或细菌)的离心洗脱(Flutria
8、tor)技术 这是美国Beckman公司近年发展的一种低速连续洗脱技术，特别适用于培养液的连续收集。使用的是带小容量连续离心池的JE-6B转子.其洗脱原理不是在一般转子中的沉降，而是被分离物在离心中的“浮选”。用4.2ml的离心池可在1小时内从100-1 000m!的原液中回收10-10，个细胞。,2.超速连续离心法超速连续离心转子是由美国Beckman公司开发的，最适用于病毒的纯化，从大量的组织匀浆中分离亚细胞组织、培养液中细菌的收集，以及污水研究。,4、离心设备分类,常用离心设备,Solids-ejecting disk bowl centrifuge of pilot size for
9、sterilizable contained installation,Nozzle machine with pressurized solids discharge for yeast and bacteria separation,常用离心设备,Decanter centrifuge,Multichamber bowl,vertical cut,管式离心设备,A disposable cell separation insert,PowerfugeTM one-chamber with scraper,Tubular bowl,碟片离心设备,(a)Solids-retaining dis
10、k bowl,(b)Radial solids-ejecting disk bowl,top feed.(c)Radial solids-ejecting disk bowl,hermetic feed.(d)Axial solids-ejecting disk bowl.(e)Nozzle bowl with pressurized solids discharge.(f)Nozzle bowl with peripheral discharge nozzles.,离心设备比较,离心机处理能力,粒子在径向上的沉降速度,轴向移动速度,完全沉降的边界条件,离心机处理能力,影响因素,处理样品的特性
11、，如密度、粒径等 溶液的特性，如密度、粘度等 离心机机械结构，如r1和r2 操作条件，,（三）、过滤,1、过滤的定义2、过滤的受力分析3、提高过滤速度的途径,1、过滤定义,过滤是利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。,过滤本身是一种膜分离技术。在分离细胞、菌体或它们的碎片过程中除了沉降分离方法外，过滤技术也是一种常备的分离方法。,2、过滤过程受力分析,推动力：过滤操作以压力差为主要推动力；阻 力：过滤过程的阻力来自多孔性过滤介 质和介质表面不断堆积形成的滤饼,过滤速率,Q：液体的流量A:面积Rm表示介质的阻力；Rc表示滤饼的阻力；L为滤液的粘度,恒压过滤方程,
12、Ruth恒压过滤方程,其中，K为Ruth恒压过滤系数，表示为,3、提高过滤速度的途径,采用絮凝或凝聚的方法预处理改变料液的性质，降低滤饼阻力加入助滤剂以改变滤饼的压缩性指数，提高过滤速度,滤饼,传统的过滤,cake,Conventional filtration,二、细胞破碎与胞内物释放,1、概述2、细胞破碎技术的分类3、常用破碎方法的介绍,学习要点,理解：各种细胞破碎方法原理、优缺点及其适用范围。应用：采用不同的细胞破碎方法对不同细胞进行不同程度的破碎。,1、概述,（1）细胞结构（2）细胞膜的组成（3）影响产物释放的因素,（1）细胞结构（真核细胞与原核细胞）,真核细胞,原核细胞,（2）细胞膜
13、组成,（A）,（B）,（3）影响产物释放的环境因素,在复杂培养基中生长的大肠杆菌细胞其破碎较单一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难；对数生长期的细胞会表现得更加脆弱。从连续培养过程中获得的、具有较高比生长速率的念珠菌的细胞壁更加脆弱，而摇瓶培养的念珠菌体则有更加充裕的机会构建更加坚固的细胞壁。酵母细胞壁的厚度和破碎阻力随年龄增长而增加经常在幼酵母细胞中出现的芽痕（Bud scars）可引起酵母细胞局部细胞壁强度的降低,2、细胞破碎技术的分类,细胞破碎的目的 是释放出细胞内含物，其方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。,细胞破碎技术分类,3、常用细胞破碎方法介绍,（1）机械破
14、碎高压匀浆,细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀杆之间的环隙高速（可达到450 m/s）喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。,缺点：,这种方法较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。,（2）机械破碎珠磨,珠磨机的破碎室内填充有8085（v/v）的玻璃（密度为2.5 g/ml）或氧化锆（密度为6.0 g/ml）的微球（粒径约0.11.0 mm）。在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球与微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击
15、而破碎。,缺点：,设备是珠后机，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。存在的问题：操作参数多，一般凭经验估计并且珠子之间的液体损失30左右。,（3）机械破碎撞击破碎,撞击破碎原理：细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为数千/min），形成粒径小于50 微米的微粒子，高速载气（如氮气，流速为300m/s）将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。,（4）机械破碎超声波破碎,压电传感器将电子振荡器的交变电流转换为声波。在超声波的作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞
16、破碎。,缺点：,超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。,非机械破碎之,酸碱处理化学试剂处理 酶溶 自溶 渗透压冲击法冻结-融化法,（5）化学渗透法,有些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。,缺点：,时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：
17、某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。,（6）酶溶法,就是用生物酶将细胞壁和细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶，-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶等。,缺点：,易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。,（7）破碎方式比较,（7）细胞破碎技术研究发展方向,1、多种破碎方法相结合2、与上游过程相结合（1）克隆噬菌体溶解基因（2）耐高温产品的基因表达3、与下游过程相结合,小结：,1、细胞分离 重力沉淀、离心沉淀、过滤2、细胞破碎 机械破碎法与非机械破碎法，不同方法的区别3、细胞破碎的发展方向。,作业：,1、常用细胞破碎方法的原理、特点及适用性。2、机械法细胞破碎方法非机械破碎方法相比有何特点？,
