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1、基因治疗（gene therapy）,主要讲授内容：一 概述二 基因治疗分类三 基因治疗的总体策略四 基因治疗的基本程序五 基因治疗应用（心血管疾病）六 展望,一引言：人类疾病，除单基因遗传病外，许多常见疾病如恶性肿瘤、高血压、糖尿病、冠心病等的发生，都是环境因子如化学物质、病毒或其它微生物、营养，以及体内的各种因素，包括精神因素、激素或中间产物等内外因素作用于人体基因的最后结果。,至于传染病，是由外源病原体如病毒、细菌及其它微生物引起的疾病，而这些病原体是通过它们的遗传物质及其表达产物作用于人体而致病。同时，这些病原体的遗传物质还可以在人体内不断复制。,所以，人的疾病的发生，都是人细胞本身的
2、基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的最后结果。为此，长期以来科学家们想象人类能否最终依靠遗传物质，无论是人本身的或外源的，来治疗疾病，包括纠正人自身基因的结构或功能上的错乱，阻止病变的进展，杀灭病变的细胞或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治疗的目的。,定义 把基因转移到患者体内，使其发挥作用，以达到治疗疾病目的的技术称为基因治疗(Gene Therapy)。,基因治疗自Anderson于1990年进行了第一例应用腺苷脱氨酶基因（ADA），经反转录病毒导入人体自身T淋巴细胞，经扩增后输回患儿体内，获得了成功。患儿5年后体内10%造血细胞ADA基因呈阳性，除了还需应用部分剂量的
3、ADA蛋白外，其他体征正常。这一成功标记着基因治疗的时代已经开始。,二 基因治疗分类：1.目的基因导入体内的方式 体外途径(ex vivo)间接法，回输法 体内途径(in vivo)直接法2.靶细胞 体细胞：疾病相关细胞，免疫系统细胞，干细胞 生殖细胞：严格禁止,间接法是指先将合适的靶细胞从体内取出，在体外扩增，并将外源基因导入细胞内使其高效表达，然后将这种基因修饰过的靶细胞回输病人体内，使外源基因在体内表达，从而达到治疗目的。,体内法是将外源基因直接或通过基因转移系统导入体内相关组织细胞，并在其中表达。导入体内之后必须进入靶细胞，有效表达并达到治疗目的。,三 基因治疗的总体策略 基因治疗是通
4、过在适当的靶细胞中有效表达重组目的基因片段而实现的。目前设计基因治疗策略的总体原则是：,1.直接补替缺陷的基因；2.抑制非正常的基因产物表达；3.以间接方式调节机体本身免疫系 统的抗病功能；4.利用外源基因对病变细胞造成特 异性杀伤。,1.基因替代和基因矫正治疗 基因替代是指正常基因原位替代缺陷基因（或变异基因）。基因矫正是指将致病基因的异常碱基序列进行纠正，而正常序列部分予以保留。,2.代偿性基因治疗 通过对有代偿功能的基因的正调控，开启其关闭状态来代偿功能异常的基因。例如，以某些作用剂提高珠蛋白基因的表达以治疗地中海贫血。,3.基因补偿性治疗 基因补偿性治疗指将目的基因导入病变细胞或其它细
5、胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得以加强。目前基因治疗多采用此种策略。,4.基因失活性治疗 基因失活性早期一般指反义核酸技术。它将特定的反义核酸，包括反义RNA、反义DNA和核酶导入细胞，在翻译和转录水平阻止某些基因的异常表达，以达到治疗疾病的目的。RNAi、肽核酸、基因敲除。,5.调控性基因治疗 通过导入编码调控蛋白的基因以治疗基因表达异常的疾病。如：以野生型P53基因治疗肺癌或急性白血病。,6.应用“自杀基因”的基因治疗 也称活化前体药物性基因治疗。某些病毒或细菌产生的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体，在人体细胞内一系列酶的催化
6、下转变为细胞毒性物质，从而导致细胞死亡。,7.免疫修饰性基因治疗 免疫修饰性基因治疗即导入能使机体产生抗病毒或抗肿瘤免疫力的基因以达到治疗目的。例如：B7共刺激分子基因及各种淋巴细胞因子基因的导入和表达，直接注入抗原基因等。,8.化疗保护性基因治疗 向正常细胞内导入单相或多相细胞毒性药物的抗性基因，使得正常细胞耐受化疗药物的能力大大提高。如：导入多药耐药基因（MDR），可使正常细胞获得广泛的化疗药物耐受性。,9.特异性细胞杀伤性基因治疗 利用DNA重组技术构建以特异性杀伤靶细胞为目标的导弹。具有导向性和杀伤性。,四.基因治疗的基本程序（一）获得目的基因 要进行基因治疗，必须首先获得目的基因并对
7、其表达调控进行详细研究。目的基因来源有多种，主要包括：含目的基因的供体细胞的基因组DNA分离、预先分离克隆的基因、PCR扩增的基因及人工合成的基因。,（二）靶细胞的选择 已被应用的靶细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌细胞及肿瘤细胞。,1.发病器官及位置。可以选择病变本身器官的细胞，也可以选择病变器官以外的细胞来作为基因治疗的靶细胞。例如：在肝脏病的基因治疗中，可以选择肝细胞作为基因治疗的靶细胞；在肿瘤基因治疗中，可选择肿瘤组织侵润的淋巴细胞或肿瘤细胞本身。,2.靶细胞应容易取出和移植 基因治疗常规途径：将靶细胞从体内取出，经基因转化后再移植回人体内。这就要求靶
8、细胞容易从体内取出和植回人体。最容易取出和移植的细胞当属血液系统的细胞。,3.靶细胞容易在体外培养4.靶细胞容易实现基因转化 将目的基因转移到靶细胞的手段主要有物理、化学、融合及病毒载体四大类。,5.靶细胞应有较长的寿命 基因治疗、特别是某些单基因遗传缺陷性疾病的基因治疗，最终目标是要求外源基因长期、稳定的表达，直至终生。,（三）基因载体和基因转移系统 目前使用的基因载体有病毒载体和非病毒载体。1.非病毒介导的基因转移 物理方法 显微注射法电穿孔法直接注射法和微粒子轰击法,化学方法 DNA-磷酸钙共沉淀法 多聚阳离子-DNA复合物法 脂质体-DNA复合物法 融合法：通过原生质球相互融合的方法，
9、将目的基因导入靶细胞。,2.病毒介导的基因转移 该类方法是以病毒为载体，将目的基因导入靶细胞或器官，并使之表达。一般在基因转移中，所使用的病毒载体都是经过改建的有复制缺陷的病毒。,这些病毒缺失了其自身复制所必需的一些基因，然后将治疗基因、一些基因的调控成分（如启动子和增强子）以及polyA信号等插入，使之成为表达性载体。目前在基因转移中所使用的病毒载体有以下几种。,1.逆转录病毒（retrovirus,RV）RV是目前基因转移中应用最为广泛的一类病毒。是一类RNA病毒。由于缺失了自身包装所必需的蛋白（结构蛋白gap，多聚酶pol，包膜糖蛋白env）基因，因此其复制需依赖辅助细胞系。逆转录病毒转
10、染效率高，理论上可高达100%。,转染后，前病毒基因组（经反转录后形成的DNA）可与靶细胞基因组随机组合，因而能稳定的表达外源基因。缺点：1）只能转染处于增殖状态的细胞；2）携带的外源基因不能太大（8-10Kb）；,3）逆转录病毒的感染依赖于靶细胞表面适宜受体存在，限制了它的应用，尤其是体内基因治疗的应用；4）理论上讲，从包装细胞释放出的复制缺陷的逆转录病毒只有一次性感染靶细胞，但在某种情况下也会造成野生型病毒的爆发。,5）由于病毒基因组是随机整合到靶细胞基因组的，因而具有致细胞癌变的可能；6）逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩等处理过程，否则会使其感染活性大大下降。,逆转录病毒载体的构建 外源基因
11、插入病毒基因组有两种方式，一种是直接将外源基因插入到病毒基因中；另一种是以外源基因取代病毒的必需结构基因。,在复制缺陷型病毒中，外源目的基因的插入使病毒基因灭火或以目的基因取代病毒的必需基因，使产生的重组前病毒不能表达病毒结构蛋白，因此转录产生的RNA不能被包装产生子代重组病毒，,必须借助辅助病毒的共感染或通过包装细胞提供病毒复制所必需的反式作用蛋白，然后才能包装产生子代重组病毒。这样获得的子代重组病毒仅仅具有一次感染性，避免了产生继发扩散感染的危险。,包装细胞（pakaging cell）包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gag、pol、env所编码的蛋白，为逆转
12、录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不能产生任何形式的病毒颗粒。,逆转录病毒载体介导基因转移的一般过程：1）目的基因克隆到逆转录病毒载体上；2）带有目的基因的逆转录病毒载体通过物理方法如磷酸钙介导或电穿孔法导入已选定的包装细胞；,3）根据载体所提供的筛选标记基因筛选转化细胞；4）选择具有高滴度重组病毒的转化细胞，分离重组病毒；5）重组病毒感染靶细胞，采用两种方式，一种是以无细胞带病毒上清和靶细胞一起温育；另一种以产病毒的包装细胞经射线照射致死后作为饲养细胞，被靶细胞在其上面培养达到目的。,6）如采用体外感染
13、，则将感染的细胞回输体内，分析治疗基因的表达及治疗效果；7）病毒感染的质量控制，在基因转移过程中要进行严格的质量控制。,基因转移的方法和途径 逆转录病毒载体系统进行基因转移的方法主要有in vivo和ex vivo两种。基因治疗的早期多采用离体方案。离体方案基因转移效率高，具有明确的基因转移，但必须进行宿主细胞的体外分离培养，而大多数人体组织细胞，原代培养比较困难。,近年来，更多采用体内方案。重组逆转录病毒直接注射的途径主要有：1）采用静脉注射等途径，将重组病毒直接注射到机体内，通过重组病毒的感染作用实现基因转移；2）直接将产生重组逆转录病毒载体的包装细胞注射到组织或肿瘤中，由包装细胞释放再感
14、染靶细胞；,3）直接将表达载体，可以是非病毒性表达质粒，注射到人体内，如将HIV-1病毒载体注射到肌肉内，使其表达相应的env基因蛋白，引起相应的细胞免疫。,2.腺病毒（adenovirus,AV）AV是一些大的（约38kb）双链DNA。目前作为基因治疗中所用的AV载体通常是一些复制缺陷病毒，其基因缺失位于基因组的E1A-E1B或E3区。,AV既能感染增殖期细胞，也能感染静止期细胞。这类病毒比较稳定，且浓缩和纯化对其感染活性影响不大。其不足之处为：1）病毒基因组一般不与靶细胞基因组整合，因而其表达外源基因是暂时的和不稳定的；,2）在AV的生活周期中，有许多不同生物学活性的蛋白暂时表达，其中也包
15、括一些与细胞恶性转化相关的蛋白；3）感染细胞内大量病毒蛋白的表达，可导致机体对受染细胞的强烈免疫应答。这一毒副作用在体内基因治疗是必须引起足够的重视。,目前有报道利用Creloxp重组构建“无内脏（gutless）”AV载体可望解决AV的免疫原性问题；4）AV几乎可以感染所有细胞，缺乏特异性。或许可以通过使用组织特异性启动子来克服这一问题。,3.腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）:AAV属于微小病毒家族成员，是一类小的单链DNA病毒（基因组约4.7kb），非常稳定。本身无致病性，需辅助病毒（常为AV）存在时才能复制。AAV可感染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。
16、,大部分AAV基因组可去除，从而可使外源基因得以大量补足。AAV可以整合进入宿主细胞基因组，但不如RV的整合效率高。有趣的是，在感染细胞中，野生型AAV基因组可高效定点整合于人类第19号染色体长臂的特定位置上，这种整合可导致染色体基因重排，,而这种重排与慢性B淋巴细胞白血病相关。然而携带治疗性基因的AAV载体似乎不象它的野生型亲本，没有定点整合于19号染色体的相同特征。因此从安全的角度来考虑，这种AAV的定点整合有多大优越性，尚值得进一步探讨。,4.单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）:HSV是一些双链DNA病毒（基因组约150kb），具有嗜神经细胞的特性，能在神经
17、细胞内形成“终生隐性感染”。将外源基因导入并使之长久存在于中枢神经系统是该类病毒载体的一大特点。,如果能够选择性地调节目的基因的表达，而不诱导病毒基因的表达，这将对中枢神经系统疾病的基因治疗大有帮助。HSV的缺点：1）仅能感染分裂细胞，从而使之在成人脑组织中的应用受到限制。2）这类病毒（包括无复制能力的病毒）对靶细胞具有毒害作用，需慎重。,（四）外源基因表达的检测 需用载体中的标记基因对转化细胞进行筛选。在较多的表达载体中都有neor 标记基因的存在，若向培养基中加入药物G418，未被转化的细胞则因不存在neor 标记基因而不能存活。,（五）回输体内 将治疗性基因修饰的靶细胞以不同的方式回输体
18、内以发挥治疗效果。如淋巴细胞可以静脉回输入血；造血细胞可采用自体骨髓移植的方法；皮肤成纤维细胞经胶原包裹后埋入皮下组织中。,四心血管病的基因治疗 近二十年来，由于心血管病发病的分子机制和基因转移技术的发展，使心脑血管病的基因治疗亦取得了十分可喜的成就。1993年Wilson应用LDLR基因治疗家族性高胆固醇血症。,1996年Isner应用血管内皮生长因子基因治疗梗塞性血管病，都已在临床应用，并获得了成功。尽管在人类已实施的近400个临床基因治疗方案中，心血管病只占5%左右，但其成功率却是最高的。,心脑血管病的基因治疗有三个最基本的条件：1治疗基因的选择，这取决于心脑血管病发病的分子生物学机制的
19、研究；2）体内基因运载系统，这是目前心脑血管病基因治疗主要的限速因素；3）治疗基因在体内的表达与调控，这是目前心脑血管病基因治疗研究中最薄弱的环节。,心血管病基因治疗的一些特点 心脑血管病主要包括单基因遗传病和多基因的心血管病两大类。前者发病率较低，主要有家族性高胆固醇血症，遗传性扩张性心肌病，肥厚性心肌病，长Q-T综合征，遗传性心肌营养不良等。这些疾病多因基因突变和缺陷所引起，,其致病基因大部分已经克隆出来。基因治疗所选择。外源基因需在体内长期，稳定表达才能有效。后者，发病率很高，主要有高血压，动脉粥样硬化，心肌肥厚，心功能不全，再狭窄等。这些疾病多是环境因素和遗传因素相互作用所引起。,心血
20、管病与肿瘤，传染病等不同，其发病过程较长，在发病的过程中存在一系列致病和抗病因素漫长的相互拮抗和调整的过程，是一系列网络调节失衡的结果。对于绝大多数的心脑血管病基因治疗的目的是促进自身的保护机制，阻断疾病发展过程中的恶性循环。,因此，对于绝大多数常见的心脑血管病的基因转移，不一定需要整合到染色体中，长期而终生表达，常常瞬间，有限的表达，阻断疾病的恶性循环即可达到治疗的目的。,心血管系统的基因转移 心血管系统的基因转移可分为间接细胞转移和直接基因转移两大类。1.基因缝线：基因缝线是一种裸DNA直接注射至体内的转移方法现在证明用裸DNA进行肌肉、血管和心肌直接注射，都可以实现局部组织的基因转移，并
21、表达出相应的蛋白质。,基因缝线是将裸DNA通过多聚赖氨酸或鱼精蛋白直接黏附在手术缝合线上，进行肌肉、血管和心肌缝合。这种方法可以避免直接注射裸DNA后的流失，使其长期滞留在局部组织，发挥持续转基因作用。,2.基因球囊和支架 基因球囊和支架是将外源基因通过多聚赖氨酸或鱼精蛋白，固定在动脉导管球囊或支架的表面，通过动脉导管送入血管局部，固定球囊和支架，令球囊加压和充气，使其紧贴在血管表面或将支架植入血管壁内。,3.血管外膜的基因转移 应用多聚凝胶（生物胶）与外源基因混合，形成基因胶或基因微球，注射在血管周围或组织内，亦可延长基因转移时间，提高转基因效率。,4.阳离子脂质体 脂质体是一种人工的脂质双
22、层结构，可以通过与细胞膜的融合或受体介导的细胞吞饮，将外源DNA送入细胞内。,5.受体介导的基因转移 在心血管细胞表面存在许多特异性的受体，当配体DNA复合物与受体结合后，可以通过受体的内趋化和胞饮作用，将外源基因特异性转移到靶细胞内。,6.病毒脂质体 病毒脂质体是将灭活的病毒或病毒的包被蛋白的片段镶嵌在阳离子脂质体的双层脂质层中所构建的一种基因载体。这种载体不含病毒的基因，仅仅利用病毒中负责感染细胞的蛋白片段。,7.病毒介导的基因转移 逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒。(一)遗传性心血管病的基因治疗家族性高胆固醇血症的基因治疗 1993年美国费城医学中心Grossman应用逆转录病毒载体携带L
23、DLR基因，治疗5例家族性高胆固醇血症的病人，取得成功。,他们首先从病人体内取出2/3的肝脏，分离出肝细胞进行体外培养，再应用重组LDLR基因的逆转录病毒，转染培养的肝细胞，经筛选和大量培养，最后通过门静脉回输到肝脏。证明其外源性野生型LDLR可以在肝脏长期表达，血浆LDL的水平明显降低，可以明显延长患者存活期。,这种方法技术复杂，费用高，可引起肝炎等免疫反应，难以普及和推广。1996年他们应用腺病毒介导极低密度脂蛋白受体基因（VLDLR）的，直接注入肝脏，证明亦可以治疗实验性高胆固醇血症，但表达时间较反转录病毒载体短，但操作简便。,北医心血管研究所最近用AV脂质体携带LDLR基因，直接从门静
24、脉注入，证明LDLR基因可以在肝细胞中高度表达，并可降低血中LDL和甘油三酯的水平，且无明显毒副作用，但持续时间短，一次注射作用只可持续2-3周。,（二）复杂性心血管病的基因治疗 除了单基因遗传性心脑血管病以外，绝大多数的心脑血管病都是多基因复杂的心脑血管病。主要包括高血压，高脂血症和动脉粥样硬化，血栓症，心功能不全，再狭窄，梗塞性血管病等等。,人们对这些疾病虽然进行了大量，长期的研究，但至今还未找到这些疾病发病的主要致病基因。绝大多数心血管疾病不一定都是基因结构的缺陷突变、缺失、重排和移位，而主要表现为基因转录表达和调控的失衡。因此，利用这些候选和调控基因，补充和促进某些基因的表达，阻遏某些
25、基因的功能，亦可达到防治疾病的目的。,1 梗塞性血管病的基因治疗 梗塞性血管病包括外周梗塞性血管病、冠状动脉梗塞、脑梗塞和再狭窄等。血管内血栓形成，血管内膜增生、高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病等都可以引起血管的阻塞，引起器官、组织的缺血、损伤和猝死。,目前主要针对不同原因和梗塞的程度采用容栓和介入疗法。严重的梗塞必须进行血管外科手术-搭桥术（bypass）。但这种方法，不仅手术复杂，费用昂贵，难以推广，而且有一定的危险。,1995年Isner最先应用VEGF基因治疗实验性外周梗塞性血管病，证明给兔肌肉内注射裸VEGF质粒，可以在肌肉局部表达，并可促进血管新生和侧枝循环的建立。1997年在美国经
26、FDA批准应用VEGF基因在临床治疗外周梗塞性血管病，并取得了明显效果：6例严重下肢缺血的患者，肌肉注射2-4mgVEGF质粒DNA，每四周重复一次，共二次，在6个病人7条患肢均观察到明显的效果。,除VEGF基因外，应用和血管生成素基因可以治疗梗塞性血管病。近年等将裸血管生成素的质粒，直接注射入家兔肌肉，证明它可促进新生血管的生成和侧枝循环的建立，治疗实验性梗塞性血管病。,2.高脂血症和动脉粥样硬化的基因治疗高脂血症是动脉粥样硬化最主要的致病因素，它是由于脂代谢障碍所引起。包括一系列载脂蛋白、脂蛋白脂肪酶、和等。这些蛋白质基因的结构、表达和功能异常可引起血浆致动脉粥样硬化的水平升高和抗动脉粥样
27、硬化的水平降低。,1.LDL受体和清道夫受体的基因 家族性高胆固醇血症主要是因为LDLR基因突变和缺失所引起的，因此，应用ex vivo 的方法，在肝脏内输入LDLR基因修饰的肝细胞，可以有效治疗家族性高胆固醇血症。应用腺病毒介导VLDLR基因亦同样有效。,1）清道夫受体（SR-B）在肝脏HDL的清除中起重要作用。剔除SR-B1基因的小鼠血浆HDL水平可升高两倍，相反在肝脏应用腺病毒介导SR-B1基因，可使血浆HDL完全消失。有人提议应用反义SR-B1，升高血浆HDL水平，治疗动脉粥样硬化。,2）APOA-1基因 载脂蛋白A1是HDL的主要载脂蛋白，它参与胆固醇的逆向转移，促使细胞内胆固醇的清
28、除。最近，Fan等构建含有APOA-1基因的逆转录病毒载体进行肌肉内基因转移，证明它可以在成肌母细胞和肌细胞中表达，升高血浆中HDL水平，若同时转移LCAT基因，效果更明显。,3）OB基因 肥胖和糖尿病亦是高脂血症和动脉粥样硬化的一个危险因素。OB基因缺陷和表达不足是引起肥胖的一个重要原因。用缺陷型腺病毒介导Leptin基因，给食饵性肥胖小鼠和遗传肥胖小鼠注射可使血浆Leptin水平增加，进食减少，体重降低，体脂丢失，血清胰岛素和糖能量恢复正常。,肌肉内注射腺病毒介导的Leptin基因，也有同样作用。应用Leptin基因可以治疗肥胖症和高脂血症。目前美国FDA已批准进行临床试验。,动脉粥样硬化
29、的发生，不仅与脂代谢有关，内皮细胞损伤，血管平滑肌细胞的增殖和迁移，血栓形成，局部过氧化和炎症反应亦是动脉粥样硬化发病的重要因素，因此抗平滑肌细胞增殖，抗血栓形成，抗炎症反应，抗氧化的基因亦可作为动脉粥样硬化的靶基因。,六 基因治疗的展望 基因治疗要取得突破，必须解决几个问题：基因导入系统；基因表达的可控性及更多更好的治疗基因。1 高效的、靶向性基因导入系统 基因治疗的关键中的首要问题是能将治疗基因输送到并进入特定靶细胞，从而要能在该细胞中得到高效表达。,2.外源基因表达的可控性 最理想的可控性是模拟人体内基因本身的调控模式。这是今后长期追求的目标。是需要全基因或包括上下游的调控区及内含子。从
30、近期来说，可以期待实现的是在cDNA水平加上部分内含子及调控元件，应用诱导的形式达到一定程度的可控性，这样部分基因，导入体内后，可通过诱导来控制表达。,3.治疗基因过少 目前在已用于临床实验的治疗基因仅集中于少数基因。尤其是，对大多数多基因疾病，如肿瘤、高血压、糖尿病、冠心病、神经退行性疾病的致病基因还有待阐明。这将有赖于人基因组计划，尤其是功能基因组学的发展。这不仅限于这些致病基因的发现，同时也包括已知和目前尚未知功能基因的表达调控序列的确定，以及其相互作用规律的阐明。,4.安全性问题5.外源基因不能在体内长期稳定表达的问题6.基因治疗的复杂性问题7.基因治疗中靶细胞生物学特性改变的问题8.论理学方面的问题。,基因治疗的历史虽短，但所取得的成绩巨大。业已显示出令人鼓舞的应用前景。随着分子生物学技术的不断完善和发展，人类后基因组计划的不断实施，对疾病复杂的分子机制有了清楚的认识，基因治疗将成为人类征服多种疾病的重要手段。,Thank you!,
