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1、蛋白质的结构与功能,第一章,Structure and Function of Protein,目的与要求学时：61、掌握蛋白质的组成、氨基酸理化性质2、掌握蛋白质各级结构、维系空间结构的化学键及结构与功能的关系3、理解蛋白质理化性质及蛋白质分离纯化方法的基本原理,什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,proteins,生物催化,运动、支持,免疫防御,代谢调节,转运、贮存,控制生长和分化,信息接受和传递,组成生物膜,蛋白质的分子组成The Molecular Component of P
2、rotein,第一节,元素组成:C(5055%)H(67%)O(1924%)N(1319%)S(04%),各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,蛋白质的含量=蛋白质含氮量 6.25,1/16,一、组成人体蛋白质的20种氨基酸均属于L-氨基酸,R,L-氨基酸的通式,碳原子,组成蛋白质的氨基酸都是L-氨基酸（甘氨酸例外）,组成蛋白质的氨基酸都是-氨基酸（脯氨酸例外）,非极性脂肪族氨基酸极性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,二、氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类,(一)侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸,(二)侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸,(三)侧链含芳香基团的
3、氨基酸是芳香族氨基酸,(四)侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸,(五)侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性氨基酸,三、氨基酸的理化性质,（一）氨基酸具有两性解离的性质,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,等电点(isoelectric point,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，分子所带的净电荷为零,呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pI=(pK1+pK2)/2,写出电离式,取兼性离子两边的pK值的平均值,（二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近
4、。,芳香族氨基酸的紫外吸收,四、蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链,肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽(peptide),+,甘氨酰甘氨酸,肽键,氨基酸残基,Polypeptide chain,N端,C端,肽,Backbone or main-chain（主链）,Side-chain（侧链）,COO-CH2,CH2,NH3+CH2CH2CH2,蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Protein,第二节,蛋白质的分子结构包括:,一级结构(primary stru
5、cture)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure),定义:蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N-端至C-端的氨基酸排列顺序。,一、一级结构（primary strcuture）,主要的化学键:肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,Proinsulin,二、多肽链的局部主链构象为蛋白质二级结构,主要的化学键：氢键,肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。,（一）肽键平面,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的
6、6个原子构成了所谓的肽单元(peptide unit)。,C是两个肽键平面的连接点,-螺旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-转角(-turn)无规卷曲(random coil),常见蛋白质二级结构类型,（二）-螺旋结构是常见的蛋白质二级结构,结构特点：右手螺旋每螺旋圈包含3.6个氨基酸残基，每个残基跨距0.15nm，螺旋上升一圈0.54nm。相邻螺旋之间通过肽键上的酰基氧与亚氨基氢 间形成氢键保持螺旋结构稳定。氢键方向与螺旋长轴基本平行。氨基酸侧链伸向螺旋外侧，对-螺旋的形成有一定影响。,（三）-折叠使多肽链形成片层结构,-折叠,蚕丝蛋白几乎都是-折叠,（四）-转角和无规
7、卷曲在蛋白质分子中普遍存在,-转角,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,（五）模体是具有特殊功能的超二级结构,在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，被称为超二级结构。,二级结构组合形式有3种：，。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,模体常见的形式,二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模体(motif)。,模体是具有特殊功能的超二级结构。,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,定义:,三、蛋白质三级结构,分子量较大的蛋白质常可折
8、叠成多个结构较为紧密的区域，并各行其功能，称为结构域(domain)。,domain motif,亚基之间的结合主要是氢键和离子键。,四、含有二条以上多肽链的蛋白质具有四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。,由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不同，则称之为异二聚体(heterodimer)。,血红蛋白的四级结构,六、蛋白质组学,（一）蛋白质组学基本概念,蛋白质组是指
9、一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质，即“一种基因组所表达的全套蛋白质”。,（二）蛋白质组学研究技术平台,蛋白质组学是高通量，高效率的研究:,双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位、切取 蛋白质点的质谱分析,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,蛋白质的鉴定,其它实验的进一步验证,蛋白质组学流程图,蛋白质样品的色谱分离,蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of
10、Protein,第三节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础,1、一级结构不同，功能不同,剩2-10,丧失活性,活性仍100,2.一级结构中“关键”部位相同，其功能也相同,例：镰刀形红细胞贫血,3.一级结构中“关键”部位不同，其生物学活性也改变,Sickle cell anemia,The sickled cells are fragile.Their breakdown leads to an anemia that leaves the victim susceptible to infections and diseases.,The elongate
11、d cells tend to block capillaries,causing inflammation and considerable pain,镰刀型贫血症在非洲发病率较高,携带者(杂合体)表现为轻度贫血，但对恶性疟疾有较强的抵抗力，由于自然选择的结果，使这一基因在非洲恶性疟疾猖獗的地区较多保留了下来。,杂合体的红细胞,肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基,血红素结构,二、蛋白质的功能依赖特定空间结构,（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似,肌红蛋白(myoglobin，Mb),肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段-螺旋结构。血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱
12、性氨基酸侧链上的正电荷相连，加之肽链中的F8组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合，所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。,血红蛋白(hemoglobin，Hb),血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结
13、合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity),血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,变构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。,（三）蛋白质构象改变可引起疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有
14、些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,疯牛病中的蛋白质构象改变,第四节,蛋白质的理化性质The Physical and Chemical Characters of Protein,一、蛋白质具有两性电离的性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧
15、基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的等电点(isoelectric point,pI),二、蛋白质具有胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,颗粒表面电荷水化膜,蛋白质胶体稳定的因素:,水化膜,带负电荷的蛋白质,溶液中蛋白质的聚沉,三、蛋白质空间结构破坏而引起变性,在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间
16、结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,蛋白质的变性(denaturation),造成变性的因素:如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。,应用举例:临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋
17、白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,蛋白质沉淀,蛋白质的凝固作用(protein coagulation),四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,五、应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质溶液含量,
18、茚三酮反应(ninhydrin reaction),双缩脲反应(biuret reaction),第五节,蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein,一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,透析(dialysis),超滤法,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法,使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白
19、质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支
20、撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,几种重要的蛋白质电泳:,四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,层析(chromatography)分离蛋白质的原理,离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gel filt
21、ration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,蛋白质分离常用的层析方法,五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient,S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,六、应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定
22、多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定,二级结构测定通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和19
23、8 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。,三级结构测定X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐补偿氨基酸替补、插入和缺失通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。,根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构：,思考题,1.名词：氨基酸的等电点（pI）；模体（motif）；结构域(domain)；蛋白质二级结构、三级结构2.蛋白质的变性(protein denature)及其应用3.何谓蛋白质的二级结构，它主要有哪几种，维持二级结构的主要化学键是什么。4.举例说明蛋白质分离纯化的方法及其原理,
