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1、2023/10/4,第四讲 蛋白质纯化色谱技术,一、色谱技术概述二、凝胶过滤色谱（GF）三、离子交换色谱（IEX）四、疏水色谱（HIC）五、反相色谱（RPC）六、亲和色谱（AC）,一、色谱技术概述,色谱法，层析法，色层法（Chromatography）是一种“分离检测”的“定量定性”分析方法19031906 俄国科学家Tswett发明分类：色谱分离方法很多，种类有四、五十种 按大类分类法：液相色谱（Liquid Chromatography）气相色谱（Gas Chromatography）按原理分类法：按形式分类法：按工作压力分类法：,色谱技术（分配色谱）,概念：色谱技术是一组相关分离方法的总
2、称，色谱柱的一般结构含有固定相（分离介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。,基本组成,流动相,泵,分离柱,检测器,输液,分离,检测,数据记录,进样器,进样,色谱图,输液泵,流速压力精度脉冲保养梯度形成,进样阀,样品,采样位置,废液,流动相,接色谱柱,手动（六通阀）进样器,（）,（）,定量环,层析柱（填料/介质）,分离的关键场所使用方法不同，先查阅说明书注意清洗保养防止气泡进入样品及缓冲液的预处理保湿,填料（层析介质）,蛋白质实验技术层析纯化,分离官能团；基质骨架；粒径/分辨率；,层析柱,监测器,紫外监测器电导监
3、测器pH值监测器保养与寿命,收集器Fraction Collector Frac-950,Rack types,4 x 96-well plates(deep or normal)+8 x 30 mm,120 x 18 mm+8 x 30 mm(standard rack),240 x 12 mm,操作系统,色谱系统,层析系统（蛋白纯化设备）,AKTA prime,AKTA purifier,Existing KTA range,KTAexplorer-fast method development,KTApurifier-high performance,KTAFPLC,KTAprime,I
4、ntroducing the new KTApilot,18,Downstream setup,STREAMLINE 200 column,containing 5 L of STREAMLINE rProtein A in expanded mode,100 L scale fermentor,1997-06-16,19,KTA,meansrealgenuinetrue,KTAdesign-an evolving platform,1996:KTAexplorer-methods and process development1997:KTApurifier-peptide and nucl
5、eic acid purification1998:KTAFPLC-high performance protein purification1999:KTAprime-simple protein purification2000:New fraction collector,sample pump and software,1997-06-16,21,KTAexplorer,Fast method and process development and scale-up for proteins,peptides and nucleic acids,Fully equipped for d
6、evelopment tasks,Options:AutosamplerSample pumpAir sensors,1997-06-16,22,KTApurifier,High performance purification and characterisation of peptides and nucleic acids,Options:AutosamplerSample pumpValvesAir sensors,Optimised for high performance purification,1997-06-16,23,KTAFPLC,High performance pur
7、ification of proteins,Reliable,well proven technology,Options:ValvesSample PumpAir sensors,1997-06-16,24,KTA prime,Reliable,well proven technology,Options:ValvesSample PumpAir sensors,色谱操作一般过程,色谱分离的基本概念,分配系数可由Langmuir方程得出Kd-分配系数q、c-溶质在固相和液相中的浓度,分配系数,蛋白质实验技术层析纯化,指一定温度下,处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以
8、K表示。K 固定相溶质浓度/流动相溶质浓度分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。,保留时间（tR）和 保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱 过程的基本热力学参数之一,阻滞因子Rf阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,理论塔板数,蛋白质实验技术层析纯化,number of theoretical plates色谱的柱效参数,用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填
9、充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。,色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N-理论塔板数 tR-保留时间 W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度 理论塔板高度：L-柱长,分辨率(Resolution),蛋白质实验技术层析纯化,分离度(Rs);表示两个洗脱位置相邻的溶质相互分离的程度。,相关视频,Tricorn柱装填；XK柱装填；柱效检测。,凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography)也称大小（体积、空间）排阻色谱，是一种根据分子的大小和形状来进行分离的方法。不同的蛋白质分子通
10、过凝胶微孔时因迁移能力不同而被分离。利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，（在其分离范围内）按分子大小将样品中各组份分离开来。大分子先被洗脱，小分子后被洗脱。,二、凝胶过滤色谱,凝胶过滤色谱原理,分子量测定,脱盐,Sephadex系：是以氯代环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶。经典的凝胶介质Sepharose系:经过纯化的琼脂糖，含极少的带电集团。型号最多、应用最广Sephacryl系：有是丙基葡聚糖与N,N-亚甲基双丙稀酰胺共聚而成。经济高效Superdex系：是葡聚糖与琼脂糖共聚而成的复合凝胶。最新，选择性强，分辨率极高,常用的凝胶介质,脱盐：Sephadex G10、25缓冲溶液交换：S
11、ephadex G10、25中间纯化：Sephadex G200精纯：Sephacryl、Superdex,常用的凝胶介质的应用,建议流速2039cm/h,建议流速3060cm/h,色谱条件的选择,凝胶介质：分离范围、分辨率。微粒越小，柱效越高，峰形越狭窄，分离度越高。流速：孔径较小较结实的填料，耐受的流速要高于孔径大的填料。上样：上样量；样品浓度70mg/ml。压力监控。,三、离子交换色谱 Ion Exchange Chromatography，IEX,分离原理：根据蛋白质的带电类型（阳离子或阴离子），以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到
12、分离的方法,阴离子交换色谱原理,基质,基质,基质,官能团,二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）,原理,蛋白质实验技术层析纯化,分离谱,蛋白质实验技术层析纯化,色谱条件,pH：阴离子交换层析：蛋白质带负电荷，则要求pHpI，但不能高于介质功能基团的pK；阳离子交换层析：蛋白质带正电荷，则要求pHpI，但不能低于介质功能基团的pK；,色谱条件,缓冲溶液：阴离子交换层析：Tris-HCl阳离子交换层析：PB上样：盐浓度上样量：载量（吸附层析）样品蛋白浓度不可过高（低于10mg/mL）；须经离心或过滤处理,吸附速度：洗脱方式：改变离子强度、pH层析聚焦（Chromatofacus
13、ing）等梯度洗脱阶段洗脱梯度洗脱洗脱速度：阶段洗脱可尽量大；梯度洗脱需根据出峰情况调整。,洗脱,蛋白质实验技术层析纯化,线性洗脱,梯度洗脱,梯度洗脱,离子交换剂的选择,考虑因素：酸碱强弱：由功能基团决定稳定性再生性经济,离子交换剂的选择,常见类型,纤维素类：无定形，分辨率和稳定性都较低 葡聚糖系：体积和流速受PH值、离子强度影响较大；琼脂糖系：最常用聚乙烯醇系(Toyopearl)：全合成的苯乙烯系（Source）：流速快，分辨率高,常用的离子交换树脂,葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephad
14、ex C-25纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B,Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,Source 系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂 S系列阴离子交换树脂 Q系列MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列,常见问题分析,不吸附：缓冲溶液PH不对；离子强度太高；峰形不稳或出现奇异峰：柱
15、床中有气泡或缓冲溶液不纯分辨率低：梯度太大；流速太高前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀,四、疏水性相互作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography）,Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity,“盐促吸附层析”在适当高盐浓度下，蛋白质的疏水残基与固定相上的疏水配基产生吸附作用。,Mec
16、hanism of HIC,Na2SO41.0 M,疏水色谱操作,疏水色谱特点,特点：它分离效率高，上样量大，特别适合分离盐析沉淀的样品。填料：烷基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶，丁基琼脂糖凝胶，辛基琼脂糖凝胶等。,疏水层析VS反相色谱,同：分离介质（固定相）吸附原理异：作用强弱 用途,五、反相色谱,原理：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子迁移速度快而先被洗脱下来。一般使用甲醇、乙腈作流动相，使得蛋白质容易变性失活；常用于HPLC分析，与在水-有机相中稳定的多肽和低分子量蛋白质的分离。,反相液相色谱,反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此
17、通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性,载体：微粒多孔硅胶（粒径5m20 m）Hypersil Spherosil XOB075固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃,Source RPC,Influence of Particle Size on the Separation effect,六、亲和色谱（Affinity chromatography）,载体活化、配基连接、吸附、洗
18、脱,原理,蛋白质实验技术层析纯化,分离谱,蛋白质实验技术层析纯化,填料（层析介质）,蛋白质实验技术层析纯化,骨架偶联配基,应用,蛋白质实验技术层析纯化,抗体纯化；IgG蛋白A重组融合蛋白（His）6标签蛋白纯化 金属离子螯合剂 GST标签蛋白纯化 谷胱甘肽 固相载体偶联配基；,缓冲液,蛋白质实验技术层析纯化,缓冲液A：缓冲液B：含竞争配体,亲和层析操作,蛋白质实验技术层析纯化,81,82,Principles of operation,Before start-upsedimented adsorbent,Equilibration(expanded),Sample applicationWa
19、shing(expanded),ElutionRegeneration(packed bed),83,Expansion vs.fluidization,Expanded bedNo pressure drop over the bedParticles move freely in solutionNo channellingNegligible back-mixing No turbulence,Fluidized bedNo pressure drop over the bedParticles move freely in solutionChannelling Extensive b
20、ack-mixing Turbulence,主要层析方法,蛋白质实验技术层析纯化,蛋白质实验技术层析纯化,蛋白质纯化策略,确定研究目标：要获得什么样的蛋白质？理化性质生物活性重点注意问题保证活性减少不必要的纯化步骤合理组织纯化步骤,色谱技术应用概况,色谱联用策略,不同色谱技术由于原理不同适用于不同的起始条件；应尽可能将不同的色谱技术联合起来，以减少中间环节：理想的情况是：前一柱洗脱液条件等同于后一柱的起始条件。,起始条件 色谱技术 结束条件小样品体积 样品被稀释 缓冲溶液被交换低离子强度 PH改变或高离子强度高离子强度 低离子强度特定的结合条件 特定的洗脱条件,色谱联用技术流程,IEX HIC GFAC GF RPC IEXHIC GF AC GF(NH4)2SO4 HIC IEX GF HIC GF IEXGF GF（脱盐）AC GF,2023/10/4,总结,一、色谱技术概述二、凝胶过滤色谱（GF）三、离子交换色谱（IEX）四、疏水色谱（HIC）五、反相色谱（RPC）六、亲和色谱（AC）,
