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1、透射电镜的生物 样品制备技术,分为两类：透射电镜样品的基本制备技术 超薄切片技术 负染技术生物样品特殊制样技术,超薄切片技术,概念:指制备厚度低于100nm的切片技术。特点：是透射电镜生物样品制备技术中最常见、最基本的技术；是其他技术方法的基础；程序长、操作较复杂、精细。,生物医学样品的特点：,1、样品多样化，包括组织、细胞、微生物及生 物大分子。2、含水量多、质地软、脱水时容易皱缩变形。3、机械程度低，对电子束轰击的耐受力差。4、多由低原子序数的元素组成，故导电性能差。5、样品形态对试剂的PH值及温度较敏感,主要步骤,取材固定脱水浸透及包埋切片染色,一.取材从人体、动植物、细胞和微生物的培养
2、物中选取电镜观察材料的过程。在活体取材时要做到：快离体12min内放入固定液准取材部位要准，有代表性小1mm1mm1mm大小，太小时结构少，太大时固定不充分结构保存不好轻动作要轻，器械要锋利冷0 4，器械、容器、固定液均需预冷,二.固定,目的尽可能保存组织和细胞在生活状态下的结构使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后 的冲洗和脱水等步骤中溶解和流失防止细胞内酶活性造成的细胞自溶 防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败致使细 胞的超微结构遭受破坏,方法物理方法快速冷冻法干燥法化学方法浸泡固定法原位固定法灌流固定法,常用固定剂,戊二醛(Glutaraldehyde，GA)无色透明液体，pH=4，使用浓度
3、为2.54，使用温度4。优点穿透能力强能较好地保存蛋白质、碳水化合物的结构及酶的活性 固定保存时间长(4可达数周至数月)缺点组织反差不好对脂类无固定作用固定后标本要充分冲洗,锇酸(Osmium tetroxide Os4),淡黄色块状结晶，使用浓度14，使用温度4。优点对蛋白质和脂类有较好的固定作用可避免组织块收缩或膨胀可产生明显的反差,锇酸(Osmium tetroxide Os4),缺点分子量大，穿透能力差对碳水化合物和酶固定效果不好固定时间较长易引起组织变脆有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用光热作用时易发生变化,多聚甲醛(Paraformaldehyde),白色粉末，使用浓度为4优点
4、对组织的浸透力强保存抗原性物质，多用于免疫电镜技术中缺点高浓度时可使组织结构流失，多不单独使用,常用缓冲液,用于配制固定液和漂洗 0.2M磷酸盐缓冲液:较常用0.2M二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细胞化学,浸泡固定法,是将所取样品直接放入预冷固定液内固定的方法，适用于大多数组织器官。最常用的是戊二醛、锇酸双重固定。操作步骤:前固定：2.5%-4%戊二醛 4 1-2h或数月漂洗：用配固定液的缓冲液 4 2-4h 中间换3次后固定：1%锇酸 4 1.5-2h（培养细胞 30min）漂洗：蒸馏水 4 10min,原位固定法,多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对缺氧比较敏感的组织。以保证器官的血液供给，避
5、免缺血造成的组织损伤或自溶。操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件下，边解剖边在取材的部位局部滴加固定液，直至组织达到适当的硬度为宜。,灌流固定法,指通过血液循环途径，将固定液灌注到组织器官内，进行固定后再取材的方法。常用于对缺氧敏感，死后变化快的组织器官，如中枢神经系统、心脏、胃肠道、视网膜和肾脏等。也可用于所取组织的种类较多以及解剖关系比较复杂、难以渗透的组织器官。包括全身灌流固定法（适用于小动物）和器官灌流固定法（适用于大动物）。,操作步骤（以全身灌流固定法为例）麻醉要进行灌流的动物,将动物固定于实验台上,打开胸腔暴露心脏,将针头刺入左心室，剪开右心耳以引出血液和灌流液。用注射器或输液
6、器缓慢注入37、0.9%NaCl,直至内脏血色消失或流出液无血色为止,注入4 固定液，待组织变硬后取材。,体外培养细胞的固定,单层细胞固定悬浮细胞固定加入融化的2%琼脂或BSA增加粘附性。离心。,三.脱 水,目的将组织内部游离的水分脱净，有利于浸透和包埋常用脱水剂乙醇:使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶 性差丙酮:可溶解脂类，与包埋剂的互溶性好，但易使组织变脆,脱水步骤,从低浓度至高浓度系列脱水50%酒精 4 1015min70%酒精 4 1015min或过夜80%酒精 室温 1015min90%酒精 室温 1015min95%酒精 室温 1015min95%酒精：95%丙酮（1：1）室温 10
7、15min95%丙酮 室温 1015min无水丙酮 室温 40min 中间换一次,四.浸透及包埋,浸透：目的是使包埋剂逐渐取代脱水剂渗透到组织细胞中。因包埋剂与脱水剂不相溶，需用一种既能与脱水剂相溶，又能与包埋剂相溶的物质进行转换，常用的转换剂为环氧丙烷。包埋：目的是让包埋剂完全浸透到组织细胞内部，使组织具有一定的硬度、弹性和韧性，能够承受切片时的各种压力，以便制备超薄切片.,常用的包埋剂,具有低黏度、亲和性强和优良的切割性能，切片透明度高，组织结构保存好，并能耐受电子束的轰击及在低温下聚合的特点。环氧树脂Epon812(进口)渗入组织容易，对细胞结构保存好，较常用。丙烯酸酯（acrylic
8、resin)618(国产),Lowcryl K4M：为低温水溶性包埋剂，较常用。特点是低温下(-35)可保持低黏度；在紫外光（波长360nm）下可聚合。聚合后可在常温下切片；能较好地保持组织结构和抗原性及植物凝血素结合部位，减少背景非特异性染色，故多用于免疫细胞化学的包埋后染色。包埋剂配方（K4M)K4M(单体）8.65g 交联剂 1.35g 引发剂 50mg,LR white:为混合的丙烯酸单体，对脂类溶解度低，保存膜结构较好，可耐受电子束轰击，因而可不做支持膜。热聚合60；冷聚合-25，加速剂协助聚合。,包埋方法,1.常规包埋方法 适用于大多数组织块及细胞团浸透环氧丙烷 室温 20min环
9、氧丙烷:包埋剂 1:1 室温 40-60min包埋剂 室温 3h包埋将样品放入包埋板或胶囊内放好标签充填满包埋剂 聚合(使包埋剂变硬)35 12h 45 12h 55 12h,2.原位包埋法,适用于组织块中数量少的特殊结构，如：运动终板；冷冻切片、半薄切片及单层培养细胞的某些结构的观察.1、组织块：前固定后用振动切片机切成50-100m的厚片，显微镜下选出含有所需结构的厚片进行漂洗。经过1%锇酸后固定，乙醇及丙酮系列脱水，环氧树脂浸透，把厚片铺于载玻片上，将顶端平整的废包埋块安在切片的特定部位上，60 聚合后修块，常规切片及染色。,2、切片及单层培养细胞（需要在玻片上进行）：在光镜下选出所需观
10、察的部位，在玻片反面用笔做好标记。前固定、漂洗、后固定，脱水及浸透同常规包埋方法，但各步骤时间可适当缩短。在玻片有标记处的正面位置滴上包埋剂，将顶端平整的废包埋块压在其上，于60 聚合硬化。将粘有包埋块的玻片置于90 热板上加温10s，取下包埋块修块，超薄切片及电子染色。,五.切片,目的：制备厚度小于100nm的切片准备工作:1.复膜载网支持膜formvar膜火棉胶膜碳膜 用于负染技术支持网铜网 常用不锈钢网、镍网、铂网（组化用）,2.制刀,3.修块目的是去除组织块周围多余的包埋介质，便于切片。半薄切片:目的是确定所要观察的准确部位，厚度为0.51m，用甲苯胺兰染色显示。,超薄切片:采用超薄切
11、片机操作步骤:包埋块固定刀固定水槽加水切片选片捞片,切片带弯曲可能原因及解决办法,支持膜的制作,支持膜是一种能支持观察样品的膜，厚度约20nm。性能良好的支持膜应具备：1.较高的透明度2.在电镜下无可见结构3.与所支持的各种样品不发生化学反应,方华膜、碳膜、火棉胶基底碳膜、硝化纤维素基底碳膜、微筛膜等,支持膜的制作,方华膜（方华的化学成分是聚乙烯醇缩甲醛，为淡黄色粉末）：准备-附膜-漂膜-捞膜,支持膜的制作,碳膜：观察高分辨率的样品及某些悬浮液对方华膜有溶解作用时需用碳膜。碳膜的机械性能及化学性能较好，减少热漂移。喷膜-漂膜摆网-捞膜,切片的厚度可根据干涉色来判断。暗灰色调 40nm 灰色 4
12、0-50nm，较薄，易被电子 束击破 银白色 60-70nm，最常用金黄色 70-80nm 紫色为 90nm以上，较厚，细节结 构不清,超薄切片质量好坏指标样品结构保存良好，结构细腻，无丢失。切片厚薄均匀，厚度在60-90nm之间。表面无皱折、刀痕、震颤等缺陷。样品反差良好，无染色沉淀。支持膜厚度适中，观察时不产生漂移和破裂。,六.电子染色,利用重金属盐类选择性地与生物样品中不同结构成分相结合，来提高结构成分散射电子的能力，从而增加图像反差的染色，又称为正染色。常用的染色剂:0.5醋酸双氧铀可使核酸、蛋白质、结缔组织纤维的反差增强。0.10.4柠檬酸铅可使膜结构、脂类的反差增强。,正染色,TE
13、M样品：超薄切片厚度要均匀无震颤无刀痕无染色污染反差适当,负染技术,指利用重金属盐类与结构背景相结合，增加背景电子散射能力，使背景呈黑色，样品结构变亮。,染色剂 磷钨酸（PTA）pH 6.7-7染色步骤 复膜载网滴样品-滴染1-2min用滤纸吸去染液观察优点 适用于悬浮液的样品（细菌、病毒、其他微生物、大分子、分离细胞器）操作快速、简便 样品用量少 图像结构反差好,小结：（超薄切片）1.取材:要求部位准确,块小,时间短,低温,器械锋利,减小机械损伤.2.固定:戊二醛固定时间可以适当延长,一般不要超过一周,期间要更换一次固定液,且要保持低温固定,充分清洗后再进行锇酸固定1-2小时,时间一定不要太
14、长.3.脱水:锇酸固定后经过充分清洗,进行酒精梯度脱水,一般50%,70%,80%,95%,无水酒精,4.样品侵透,包埋.一定要保持干燥,侵透彻底.5.聚合:由室温到高温梯度升温聚合.如35度,45度,60度顺序.6.超薄切片:切片机性能,片厚度,捞片,载网质量都需要注意.7.电子染色:过程中一定要避免一切污染.,注意事项（负染）,样品浓度要适中 样品要不含杂质 样品的pH值要与染液pH值一致 掌握滴染时机（样品要未完全干燥时）负染样品观察时，加速电压要适当,物镜光阑要小，反差较好，照相要快.,Fig.1.The labelling results of colloidal gold prob
15、e.A:colloidal gold,B:labeled colloidal gold(showing the protein halo around the labeled particles).,Fig.4.Colloidal gold nanoparticles(20 nm).1:anti-TTX Mab labelled colloidal gold nanoparticles(showing the protein halo around the labelled nanoparticles),2:unlabelled colloidal gold nanoparticles.,Food Chemistry,
