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1、铜绿假单胞菌耐药研究进展,1.铜绿假单胞菌的流行病学、病原学、临床意义2.铜绿假单胞菌的实验室检查3.铜绿假单胞菌感染的治疗方案4.铜绿假单胞菌的耐药机制5.研究进展,主要内容,流行病学,本菌为条件致病菌，广泛存在于自然界、土壤、水、空气，在正常人皮肤（如腋下、会阴部和耳道内）、呼吸道和肠道均存在。其生存的重要条件是潮湿环境，对外界环境抵抗力较强，湿热55、1h方能杀灭，对紫外线不敏感。儿童带菌率比成人高,应用抗生素治疗者带菌率增高。住院病人，特别是使用抗生素、糖皮质激素或免疫抑制剂治疗的病人，呼吸道内该菌的寄植增多。,流行病学,感染途径：内源性：自身上呼吸道、肠道、皮肤、生殖道等外源性：其他
2、病人或带菌的健康工作人员，经手、飞沫或污染的医疗器械而传播。,病原学,革兰氏阴性杆菌，单个、成对或短链状排列。多数菌株分泌绿脓菌素和荧光素，呈蓝绿色，故名绿脓杆菌。菌体一端有13根鞭毛，故有动力，较活泼，无荚膜或芽胞。专性需氧菌，生长要求不高，在普通培养基上生长良好，最适宜温度为35。有很强的蛋白分解能力，但发酵糖类能力低。,致病性,临床意义,经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。本菌所致感染的临床表现取决于受累部位。,化脓性内眼炎,继发性铜绿假单胞菌感染,脓液 痰 尿液等血液 环
3、境用品 分离培养 直接涂片染色肉汤增菌 血平板、MAC 37 18-24h 可疑菌落（金属光泽、-溶血、产绿色素、特殊气味）初步鉴定 最后鉴定 菌落 色素 非发酵菌鉴定系统鉴定 革兰阴性杆菌 氧化酶(+)血清分型 检验程序,为革兰阴性菌，菌体大小（1.55.0)um宽(0.51)um，细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，无芽胞,革兰染色,电镜,直接检镜,分离培养,专性需氧、营养要求不高普通培养基：18-24h圆形、大小不一、边缘不整 扁平、湿润、金属光泽常呈融合态，琼脂被染成绿或黄绿。MAC：微小无光泽半透明 48h后菌落呈棕色血平版：扁平 湿润 有金属光
4、泽 琼脂被染成蓝绿或灰绿 有透明溶血环有特殊生姜气味,普通平板,MAC平板,血平板,生化实验,该菌氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖和木糖，产酸不产气，但不分解乳糖和蔗糖。液化明胶、可分解尿素，还原硝酸盐为亚硝酸盐并产生氮气，吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶阳性。生长实验：该菌在4不生长而在42可以生长分型（1）噬菌体分型：所应用的噬菌体现有24株，分型率达90%。（2）血清学分型：利用O抗原进行分型，可分20个血清型。（3）核酸检测：质粒指纹图谱分型、脉冲场凝胶电泳分型、其他快速分子生物学（基因芯片、PCR技术、16SrDNA分型）鉴定,常见非发酵菌初步分群鉴定,试验 假单胞 不动杆 产碱杆
5、 黄杆 莫拉 菌属 菌 属 菌 属 菌属 菌属 氧化酶+-+葡萄糖O/F O/-O/-O/F-动力+-+-MAC平板生长+/-,鉴定,初步鉴定 菌体形态 菌落特征 产色素 气味 氧化酶最终鉴定 非发酵菌生化鉴定系统 API-NE试条 注意：实验室诊断应与临床表现相结合,药物治疗,传统药物治疗,哌拉西林，替卡西林头孢他啶，头孢哌酮哌拉西林/他唑巴坦替卡西林/克拉维酸头孢哌酮舒巴坦环丙沙星，左氧氟沙星多粘菌素类（多粘菌素类B、E）,新研发的抗假单胞菌药物,多利培南（Doripenem）西他沙（sitafloxacin）比阿培南（Biapenem）,铜绿假单胞菌对以下药物具有天然耐药性：氨苄西林、阿
6、莫西林、阿莫西林/克拉维酸、第一、二代头孢菌素、头孢噻肟、头孢曲松、萘啶酸和甲氧嘧啶等。,耐药机制,耐药机制,1.外膜通透性减低2.主动外排泵系统3.抗菌药物作用的靶位的改变4.产生灭活酶5.生物膜（BF）的形成,1.外膜通透性障碍,抗生素通过两种途径进入细菌外膜，亲水性抗生素的孔蛋白通道和疏水性抗生素的脂质介导通道。如果这些通道改变或缺失，抗生素将不能进入细菌到达作用靶位，从而使细菌产生耐药性。PA的外膜通透性极低，仅为大肠埃希菌的1%-8%，这是PA对多种抗生素天然耐药的重要原因之一。内酰胺类、四环素、氯霉素、喹诺酮类只能通过孔蛋白提供的水通道跨越外膜。,1.外膜通透性障碍,PA外膜蛋白中
7、的OprC、OprD、OprE是小分子亲水性抗生素进入细菌的通道，OprF形成大孔通道。孔蛋白数量的减少或基因突变影响外膜对抗生素的通透性。孔蛋白形成的通道部分具有特异性，如OprD2孔道是亚胺培南选择性快速进入菌体的特异性通道，如果OprD2蛋白缺失或者表达减少是导致PA对亚胺培南耐药的机制之一，但对美罗培南却无影响。,1.外膜通透性障碍,氨基糖苷类和多粘菌素E并不通过外膜孔蛋白进入细胞内，而是先粘附在外膜的脂多糖上，再促进自身被细菌摄入，干涉细菌核糖体蛋白质的合成，进而产生抗菌作用。OprH的过度表达可防碍氨基糖苷类和多粘菌素E的粘附作用，从而导致耐药，但是这种耐药形式尚未在临床菌株中广泛
8、发现。,2.主动外排泵系统,外排泵由三部分组成：外膜蛋白：形成门通道，有利于底物通过外膜；膜融合蛋白或连结蛋白，连接内、外膜蛋白；内膜蛋白，为主要的泵出蛋白，具有识别底物的作用，但不具特异性。,3.药物作用靶位的改变,青霉素结合蛋白（penicilin binding proteins,PBPs）PBPs数量、结构的改变导致其与抗生素亲和力降低，产生缓慢结合的PBPs或者诱导性PBPs增多均能导致PA对内酰胺类抗生素产生耐药。,DNA解旋酶和拓扑异构酶位点改变,此外，二氢叶酸合成酶发生结构改变，可使磺胺类药物的亲和力降低，从而引起对磺胺类药物耐药；,氨基糖苷类抗生素的作用靶位16SrRNA发生
9、基因突变也可导致PA对氨基糖苷类抗生素耐药。,3.产生灭活酶（氨基糖苷类修饰酶）,AMEs由质粒编码，可分为乙酰转移酶、磷酸转移酶和核苷酸转移酶三类。氨基糖苷类修饰酶（AMEs）能将氨基糖苷类抗生素的游离氨基乙酰化，将游离羧基磷酸化、核苷化，使氨基糖苷类抗生素发生钝化，不易进入菌体内，也不易与细菌内靶位（核糖体30S亚基）结合，从而失去抑制蛋白质合成的能力，因此细菌在抗生素存在的情况下仍能存活。,4.产生灭活酶（内酰胺酶BLA）,超广谱-内酰胺酶（ESBLs）金属-内酰胺酶（MBLs）又称金属酶或碳青霉烯酶，MBLs通过半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸等活性位点的氨基酸与锌离子结合，锌再结合水分子使
10、其活化，成为亲核试剂，从而水解包括碳青霉烯类在内的几乎所有-内酰胺类抗菌药物，其活性不能被克拉维酸、他唑巴坦等常见的-内酰胺酶抑制剂抑制。主要由假单胞菌属、脆弱拟杆菌属、产黄菌属、沙雷菌属及嗜麦芽黄单胞杆菌属产生。头孢菌素酶（AmpC酶）AmpC酶作用于头孢菌素，但不被-内酰胺酶抑制剂抑制。PA中的AmpC酶是典型的诱导酶。产生菌主要是革兰阴性菌，如假单胞菌、肠杆菌、不动杆菌和克雷伯杆菌等，由染色体介导。,5.生物膜（BF）的形成,生物膜是指细菌吸附于生物材料（气管插管）或机体腔道表面，分泌胞外多糖（EPS)、纤维蛋白、脂蛋白等，将自身包绕其中而形成的膜样物质。,相关耐药性的最新研究,铜绿假单
11、胞菌（）的多药耐药机制复杂，产内酰胺酶是其重要机制之一。研究表明，、种内酰胺酶基因在PAE中检出率高。产 型金属内酰胺酶是医院耐亚胺培南的主要机制之一。细菌外膜孔蛋白缺失与耐亚胺培南的关系有待进一步研究。对氨基糖苷类抗菌药物耐药是因为产氨基糖苷类修饰酶（）和作用靶位基因突变而致。阿米卡星修饰酶（）和核苷转移酶（）较常见。（）引起对阿米卡星、妥布霉素耐药，（）引起对庆大霉素、妥布霉素耐药，（）引起对庆大霉素、妥布霉素耐药。普通组PAE（）、（）检出率为100%，（）检出率为52.2，但铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素敏感。泛耐药组基因检出率与耐药性成正比。产生不是细菌耐氨基糖苷类抗菌药物的决定性因素。,PA耐药的控制策略,政府：加强药政管理医院：合理应用抗菌药物，严格掌握用药适应征 及早做出病原学诊断，有针对性地使用抗生素 加强细菌耐药性检测，限制某些抗菌药物使用 严格执行消毒隔离制度 药企：新抗菌药物和质粒消除剂的研制,
