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1、食源性疾病实验室检测技术要点,温州市CDC微生物检验科 李毅,前言,食物中毒应急处理与现场调查,现场调查中的实验室支持,概念与分类,前言,食品安全事故流行病学调查工作规范 卫监督发201186号 本规范自2012年1月1日起施行,食品安全事故流行病学调查工作规范,主要内容包括1、总则2、调查机构管理3、调查内容和程序 5部分主要内容和总共23条4、调查结论和报告5、附则,第三条 事故流行病学调查包括人群流行病学调查、危害因素调查和实验室检验，具体调查技术应当遵循流行病学调查相关技术指南。第六条 事故流行病学调查实行调查员制度。各级调查机构应当根据工作需要配备事故流行病学调查员。调查员应当由具有
2、1年以上流行病学调查工作经验的卫生相关专业人员担任。经专业培训考核合格后，由同级卫生行政部门聘任。,食品安全事故流行病学调查工作规范,食品安全事故流行病学调查工作规范,第九条 事故流行病学调查由调查机构成立的事故流行病学调查组（以下简称调查组）具体实施。调查组应当由3名以上调查员组成，并指定1名负责人。第十一条 开展人群流行病学调查应当包括以下内容：（一）制订病例定义，开展病例搜索；（二）统一个案调查方法，开展个案调查；（三）采集有关标本和样品；（四）描述发病人群、发病时间和发病地区分布特征；（五）初步判断事故可疑致病因素、可疑餐次和可疑食品；（六）根据调查需要，开展病例对照研究或队列研究。,
3、食品安全事故流行病学调查工作规范,第十二条 开展危害因素调查应当包括以下内容：（一）访谈相关人员，查阅有关资料，获取就餐环境、可疑食品、配方、加工工艺流程、生产经营过程危害因素控制、生产经营记录、从业人员健康状况等信息（二）现场调查可疑食品的原料、生产加工、储存、运输、销售、食用等过程中的相关危害因素；（三）采集可疑食品、原料、半成品、环境样品等，以及相关从业人员生物标本。,食品安全事故流行病学调查工作规范,第十三条 送检标本和样品应当由调查员提供检验项目和样品相关信息，由具备检验能力的技术机构检验。标本和样品应当尽可能在采集后24小时内进行检验。实验室应当妥善保存标本和样品，并按照规定期限留
4、样。,(一)概念,食源性疾病 指通过摄食而进入人体的有毒有害物质（包括生物性病原体）等致病因子所造成的疾病。一般可分为感染性和中毒性，包括常见的食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、寄生虫病以及化学性有毒有害物质所引起的疾病。（WHO）食物中毒 指食用了被有毒有害物质污染或含有有毒有害物质的食品后出现的急性、亚急性疾病；食源性疾病有暴发和散发两种形式，食物中毒是食源性疾病的暴发形式,食品安全事故,指食物中毒、食源性疾病、食品污染等源于食品，对人体健康有危害或者可能有危害的事故。,食源性疾病的分类,食物中毒（急性）食源性肠道传染病食源性寄生虫病变态反应性疾病（食物过敏）暴饮暴食引起的急性胃肠炎等
5、一次大量或长期低剂量摄入某些有毒、有害物质引起的以慢性毒害为主要特征的疾病，食物营养不平衡所造成的某些慢性疾病等,概述,食物中毒应急处理与现场调查,为了及时准确掌握食物中毒发生原因，积极采取有效防范措施，在食物 中毒调查时，要按照一定程序开展工作。食物中毒事故处理办法 卫生部1999 突发公共卫生事件应急条例 国务院2003年5月7日 食品安全法 2009年2月28日中华人民共和国食品安全法实施条例 食品安全事故流行病学调查工作规范 2011年,相关法律法规,食物中毒应急处理组织与职责,食物中毒应急处理涉及 卫生行政部门 卫生监督机构 疾病预防控制机构 医疗救治机构 其他有关部门,食物中毒报告
6、、信息管理制度,1.食物中毒一般报告制度2.食物中毒紧急报告制度（1）中毒人数超过30人的应当于6小时内报告同级人民政府和上级人民政府卫生行政部门；（2）中毒人数超过100人或者死亡1人以上的，应当于6小时内上报卫生部，并同时报告同级人民政府和上级人民政府卫生行政部门；（3）中毒事故发生在学校、地区性或全国性重要活动期间的应当于6小时内上报卫生部，并同时报告同级人民政府和上级人民政府卫生行政部门；（4）其它需要实施紧急报告制度的食物中毒事故。,食物中毒应急处理准备,一、应急处理准备原则要求“预防为主、常备不懈”二、重大食物中毒应急处理准备与支援（一）食物中毒监测与预警（二）资金储备（三）食物中
7、毒物资准备三、食物中毒应急处理演练四、预防和控制食物中毒的宣传和公众教育,食物中毒应急物资准备,1.食物中毒事故应急处理专用车辆：配备救护顶灯、车载电话、储物小冰箱、打印传真机等。2.采样用物品（食品、现场涂抹样品、便样、患者呕吐物、血样等）3.音像取证工具：录音机（笔）、照相机、摄像机各1部。4.现场快速检验、测量设备：食物中毒快速检样箱，食品温度测试计、消毒剂浓度检测试纸等。5.法律文书：食物中毒事故个案调查登记表、现场卫生监督笔录、现场检查笔录、调查笔录、样品采集记录表、采样记录、样品送检单、先行登记保存证物通知书及存根、卫生监督意见书、责令改正通知书、卫生行政控制决定书、封条、送达回执
8、等。6.参考资料：食物中毒诊断标准、有关卫生部规章、参考书籍等。7.其它有关物品：如便携式电脑、手机或对讲机等通讯设施以及用于保存运送培养基的冰箱、冰块等,病因初步判断,症状体征 微生物食物中毒大多为急性胃肠炎症状。如霍乱弧菌中毒表现为呕吐、泻水、脱水、体温下降等；沙门菌、志贺菌中毒表现为腹痛、腹泻、发热等；变形杆菌中毒以上腹部刀绞样疼痛及急性胃肠炎症状为主；葡萄球菌肠毒素引起胃肠炎，神经系统症状（肉毒毒素、真菌毒素、化学毒物）；呼吸道症状（链球菌等）；甲醇中毒主要表现为视觉障碍、复视、失明；亚硝酸盐中毒主要表现为缺氧症状，呼吸浅表、窒息；毒鼠强、氟乙酰胺主要表现为恶心、头痛、痉挛、肌肉震颤、
9、流涎、大小便失禁等；有机磷中毒主要表现为毒蕈碱样和烟碱样中毒症状；氰化物中毒主要表现为闪电样击倒，迅速死亡；安眠镇静药、一氧化碳、吗啡中毒主要表现为昏睡，等等。,病因初步判断,潜伏期 平均潜伏期意义：是确诊标准之一；用于估计事故发生发展态势；决定调查起点餐次；确定采取防治措施的时间范围，并考核防治措施效果。,病因初步判断,4类食物中毒的潜伏期一般是：1 h 时，可能是化学性食物中毒；17 h时，可能是金葡菌或腊样芽胞杆菌；814 h时，可能是细菌性；15 h 时，可能是其它因素。5.我省常见的食物中毒及其平均潜伏期(1)副溶血性弧菌(嗜盐菌)食物中毒：海产品食物引起为主(鱼鲜、蛏、蛤、熟鱼、咸
10、鱼、虾等)，海产品带菌率可高达4585%，潜伏期1018 h(330 h)。(2)沙门氏菌食物中毒：蛋、禽、肉、奶食物为主(例如1987年某市食用污染蛋品制造的冰淇淋，导致1113人发病)，潜伏期1214 h(648 h),病因初步判断,(3)有毒动植物中毒：我省山区蘑菇有毒者可占50%以上。毒蘑菇毒素中毒潜伏期 2 h。(4)河豚鱼中毒：病死率可达33%。鱼类组织胺中毒潜伏期13 h；河豚鱼1045(103 h)。(5)有机磷农药中毒：食用污染蔬菜或农田施药者发病，潜伏期可短至几分钟。(6)腊样芽胞杆菌中毒：致吐性毒素0.52 h(16 h)；致泻性毒素1012 h(616 h)。(7)葡萄
11、球菌肠毒素中毒：潜伏期24 h(0.57 h)。(8)霍乱(可造成食物中毒型暴发)：潜伏期15天。(9)化学性食物中毒潜伏期较为复杂，有食后几分钟到几小时内发病的如亚硝酸盐、砷化物、磷化物、发芽土豆、苦杏仁、生物碱等，有潜伏期较长的如毒蕈、敌鼠钠盐，一般进食后l3 d内发病,病因初步判断,季节性:微生物食物中毒具有季节性，多发生在夏秋季。而化学性食物中毒没有季节性 相关食品 肉奶蛋（沙门菌、弯曲菌、金葡）水产品（弧菌、河豚鱼、贝类毒素）剩米饭（蜡样芽孢杆菌）变质甘蔗、酵米面、变质银耳、扁豆、鱼胆,细菌性食源性疾病的主要表现,细菌性食源性疾病的主要表现,细菌性食源性疾病的主要表现,细菌性食源性疾
12、病的主要表现,现场调查,参与抢救病人,患者调查,可疑食物调查,从业人员健康调查,临床症状,进餐史,采样,加工制售环节,环境卫生,采样,医务室查询,病假情况,采样,现场处理,行政控制,追回销毁中毒食物,指导现场消毒处理,修定治疗方案,流学病学资料,定案,实验室诊断,行政处罚,结案,上报,食物中毒现场调查处理,食物中毒事故个案调查登记表对病人的调查应注意以下环节：1.对最早发病和症状较重的病人进行重点调查。2.尽可能调查到所有中毒病人，当出现大规模食物中毒（数百人中毒）时，可以先整群抽样进行调查。3.对每项症状和体征进行仔细询问和记录。不仅要调查是否出现发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，还应注意
13、其程度、频率、部位、出现的先后顺序等，这些情况对鉴别诊断均有重要意义。,食物中毒现场调查处理,4.应特别注意是否出现特殊临床表现5.确定最早发病和最晚发病的病人6.临床检验结果调查。如血常规、便常规对诊断细菌性食物中毒有重要意义7.对临床治疗措施及其效果进行询问和记录8.仔细询问病人进餐情况。首先要求供餐者提供真实的食谱，根据食谱询问进餐史。,食物中毒现场调查处理,9.一餐食品品种较多时，可以先把各种食品列表分别进行询问调查，再进行统计分析。10.对一定数量的同餐就餐而没有发病者的进餐情况进行调查11.调查时应注意了解是否存在食物之外的其它可能与发病有关的暴露因素，以排除或确定非食源性疾病。,
14、食物中毒现场调查处理,可在现场进行快速检验，也可进行简易动物试验进行快速检验时一定要设阴性对照和阳性对照，并由有一定检验经验的调查人员进行操作。样品还应送实验室进一步按照标准检验方法进行确认。简易动物试验对快速查明含有毒性很强致病物质的中毒食品可以起到很大帮助。,现场快速检验、简易动物实验,调查可疑中毒食品加工销售过程,确定调查的重点食品。食物的来源、加工方法、加工过程（包括使用的原料和配料、调料、食品容器）、存放条件和食用方法、进食人员及食用量等情况。了解厨师或其它食品加工人员的健康状况。不能仅仅检查健康证，是否患有腹泻、手外伤、皮肤病等有碍食品卫生的疾病。可疑中毒食品加工的数量、销售数量及
15、流向。对违反法律、法规的情况均应以现场卫生监督笔录或调查笔录的形式予以记录，必要时进行照相、录相。,调查时应对加工人员叙述的每一句话、每一个环节进行分析，根据现场情况和所提供的证据判断其真伪，必要时现场重复模拟操作。对加工人员应分别单独进行调查，以相互印证提供的情况。,调查可疑中毒食品加工销售过程,食物中毒调查的整个过程从某种意义上是一个取证的过程，调查人员必须注意证据的客观性，关联性和法律性，要充分利用录音机、照相机、摄像机等手段，记录下当事人谈话和现场卫生状况。在同有关人员进行询问调查时，必须做好个案询问笔录，现场检查完毕，如实、客观记录下现场检查情况，并经被调查人阅后签字认可。卫生行政部
16、门应认真审查食物中毒的全部证据材料，不足的，及时补充或纠正，要求事实清楚、证据确凿充分。,取 证,严格控制封存范围，尽量缩短控制时间，避免将不相干的食品和物品列入封存范围，能封存部分的，不封存全部。对易腐易坏的食品物品，应尽量缩短封存时限，在责令当事人承担保全责任时，酌情予以一定帮助。对封存价值高，批量大的食品、物品时要注意听取当事人的陈述和申辩，要把法律的规定讲深讲透，避免简单、粗暴。尽量减少敌对情绪。当周围群众表示不满时，应做出必要的解释，争取支持与协助 检验和卫生学评价后认为可解封的应尽快解封。,行政控制的注意事项,现 场 调 查 中 的 实 验 室 支 持,实验室诊断的目的意义,识别暴
17、发、确定病因 确定传染来源 确定流行范围 确定传播链 发现特殊的毒株 判断院内交叉感染 疫苗实施项目的考核 仲裁依据,临床,实验室,流调,围绕病因假设进行进一步证实共同的危险因素,专业知识、经验充分物质准备高度的责任心,围绕病因假设,采集实验样品、确定检验项目,采 样,样品的采集对食源性疾病的明确的诊断和对病人的急救治疗都有重要意义。调查员(经过培训)应认真准备好采样器材(灭菌采样容器，运送培养基、无菌棉签、采血针筒、试管等)，与其他调查员共同深人现场，分析中毒的原因。明确检验目的，突出重点。采样应做到及时、正确、有代表性并注意无菌操作。,样 品 采 集,1.食品样品采集 可疑食品是食物中毒检
18、验最重要的样品，由于食物中毒是群发性的，所以患者共同食用，且在加工、储藏过程中，最有可能受到细菌污染的食物是首选的采集样品。包括成品、半成品、调料、生鲜原料、蘑菇等。（1）调查人员应对食品加工场所进行认真全面搜查，以客观结果判断是否还存在剩余食品或者原料。（2）餐桌上的剩余食物为最好的样品，应及时采取；残余食物将残余食物用灭菌镊子或勺采取，置入灭菌之容器内.（3）如无剩余食物时，可用灭菌棉拭涂擦盛可疑食物的容器表面或采取容器的灭菌生理盐水洗液作为样品。（4）体积较大的肉食与鱼类等，应将表面消毒后，取内部样品置于无菌容器内；（5）采集同一加工场所加工的其它直接入口食品；（6）必要时也可采取半成品
19、或原料。若是化学性、有毒动植物食物中毒采集食品原料尤为重要。（7）罐头检样直接采取，若仅剩空盒，可将空盒送检。,样 品 采 集,2.炊具、食具、容器：对于刀、墩、容器、冰箱、水池、下水道口、设备、工具等可能直接或间接接触可疑中毒食品的物品表面，可用灭菌棉拭蘸取灭菌盐水反复涂檫后，将棉拭置于灭菌容器内。菜墩表面用灭菌刀刮取木屑置于灭菌容器内。抹布可用灭菌剪刀剪取一块置于灭菌容器内。这类采样主要针对细菌性食源性疾病；3.大便样品采集（1）最好用便盒或采便管采集腹泻病人大便；（2）无论中毒病人是否已经服药，均应进行大便采集。（3）应选择发病初期具有同样症状且较严重病例的大便。（4）采集时应避免混入其
20、他物质。,样 品 采 集,肛拭采样,A、采样人员采样前检查肛拭管表面是否光滑、有无破损及裂痕以防意外；B、采样者采样时嘱被检者放松，充分暴露其肛门，避开内外痔，将肛拭管轻轻插入肛门约5cm，儿童约-3cm,轻轻转动几圈，擦取直肠表面的粘液后取出，放入增菌液或C-B运送培养基中。C、为防止污染，采集标本时应将装有增菌液的试管口在酒精灯火焰上灭菌。,4.呕吐物采集 呕吐物已被处理掉时，涂抹被呕吐物污染的物品,或采集洗胃液。5.血液采集如怀疑是沙门菌、变形杆菌、致泻大肠艾希菌食物中毒时，应分别在患者急性期（3天以内）和恢复期（2周左右）各采取血液2-3毫升，待凝固时分离血清，做抗体滴度测定。同时采集
21、正常人静脉血作为对照。6.食品加工人员带菌情况在细菌性食物中毒的调查、检验过程中，除必须确定致病菌外，还必须追踪这些致病菌的来源，应根据食物中毒情况，采集售货员或制做食品的工作人员及直接或间接接触食品的有关人员的检样，特别是那些在中毒发生前或正在患有肠炎、发烧、化脓及可疑带菌者进行采样。可采样手、鼻、咽和有感染灶的皮肤等涂抹样、便样。7.尿液采集,样 品 采 集,8.水样采集在调查水域污染状况时，需进行综合分析判断，抓住基本点（如水流入前、流入后充分混合的地点，用水地点，流出地点等），以取得代表性水样。对江河、湖泊、泉水、井水等水源采样时，将容器浸入水体中，待水至容器23处时取出。在采集管网系
22、统水样前，先消毒，再放水5分钟，以保证样品具有代表性。严格按无菌采样规范要求采样。,采什么样,9.组织器官标本：组织器官采集包括尸解或手术后采取的胃、肝、肾、肺等重要器官标本,尸解最好在病人死亡后48 h内进行,要注意防止所用器械带来污染。每一采集部位应更换消毒器械,每种组织应多部位采集,每份标本应采集50100 g 于无菌洁净容器中,分别保存冷藏送检。10.其它采样 对厨房、仓库、储藏室中发现的鼠及粪便、猫、狗等亦需采样。在肉毒中性毒素中毒时，对做食品的原料和周围的土壤亦需采样。,样 品 采 集,食物中毒采样数量 样品种类 检验目的 样品量 饮用水 全分析及致病菌 5 L 液体食品 致病菌或
23、毒物分析 可疑食物200ml 固体食品 致病菌或毒物分析 可疑食物200g 呕吐物 致病菌或毒物分析 50g(ml)洗胃液 致病菌或毒物分析 200ml 腹泻物 致病菌或毒物分析 50g(ml)血液 病原分离、抗体分析 5ml 脑脊液 病原分离 2ml 皮损分泌物 病原分析 灭菌生理盐水浸泡棉签涂取,采多少,所有标本在采集时立即分装，一式 N 份(不同检验项目、重复实验、其它实验室复核、留样),采什么样,对 照内对照外对照,暴发性食源性疾病,多途径传播疾病（大肠杆菌O157:H7）潜伏期长的疾病（伤寒、李斯特菌等）非消化道症状的疾病水源性传播疾病,需注意,什么时间采,采样时间氟乙酰胺在体内数小
24、时后就开始转化为氟乙酸，血中在十余小时或数天后就检不出了氟乙酰胺，这个阶段体内氟乙酸浓度仍较高，所以应该采集患者的血样或尿样来检测氟乙酸；毒鼠强在体内代谢缓慢，中毒后数月后采集的血样对病因确定仍有重要价值。血清：如怀疑是沙门菌、变形杆菌、致泻大肠艾希菌食物中毒时，应分别在患者急性期（3天以内）和恢复期（2周左右）各采取血液23毫升，待凝固时分离血清，做抗体滴度测定。如做血液细菌培养时，应将采取的血液直接注入含有玻璃株的无菌小烧瓶中进行振摇，然后加入相应培养基或直接将血液注入培养基中。如怀疑副溶血性弧菌食物中毒时，应分别在患者中毒12天和1周时采取血液做抗体滴度测定。（因1周后抗体就降低或消失）
25、。病毒分离标本最好在发病初期（1-2天）采,样 品 采 集,怎么采,不同检验目的的样品细菌分离 病毒分离抗原-抗体检测化学毒物检测无菌部位基因检测木制的棉拭子？,食物中毒事件怎么采,粪便可直接采取或采便管插入直肠采集；呕吐物可注入灭菌试管内，由于胃酸能使样品为酸性，不利于细菌的存活，所以应在采集的呕吐物内加入10苏打予以中和，以保持细菌的活性。咽喉涂抹样可用棉签涂擦咽喉部采取洗胃液直接抽取注入灭菌容器内。血液血样的采集应尽早抽取患者的血液，在中毒患者急性期必要时可作血样培养，但主要是用来检测患者血液中的抗体。一般需采血二次以上，第一次在发病初期(3天以内)，第二次是在恢复期(2周左右)，若患者
26、血中抗体呈明显上升趋势，即可证实其受到过相应致病菌的感染。方法是从肘静脉采取血液23ml，注入干热灭菌试管内，使成斜面，待凝固后，分出血清送检。如做血液细菌培养，可直接注入灭菌并带有玻璃珠的三角瓶中，立即振摇数分钟，以防凝固，然后送检。,食物中毒事件怎么采,(3)对可疑中毒患者在解剖前不要将尸体用福尔马林、酒精等化学物处理，解剖台要冲洗干净，所用的解剖器具、手套要预先冲洗干净、晾干备用，不要沾染消毒药液（如来苏、酒精、升汞溶液等）以免污染了检材。例如在解剖时使用了升汞溶液浸泡过的手套，手套上的升汞就可能对样本污染，会干扰了病因的判定。在尸体周围不要喷洒农药灭蚊蝇，以免污染可能用于毒物分析的检材
27、。尸体解剖检样可采取胃肠内容物、脏器、肠系膜淋巴结及血液等。内容物用灭菌注射器或灭菌器械采取，置入灭菌瓶内；脏器应先用烙铁烧灼消毒表面，再用解剖刀剪和镊子取内部检样1020克，置于灭菌容器内送检。血液及体液用灭菌注射器直接抽取或用灭菌棉签蘸取。对死亡患者一般从心腔内采集血液，也可采集腋下静脉、颈静脉、股静脉血液，心腔内血液和周围血中毒物浓度不同。,食物中毒事件怎么采,疑为百草枯中毒患者的血液不能用玻璃试管，因为玻璃可以使百草枯钝化，钝化后的百草枯实验室是不能检出的。疑为一氧化碳中毒者应尽早抽血5-15毫升注入玻璃试管内，量要直装至瓶口，必须用密封玻璃塞塞紧，避免瓶中残留空气，血液是分析一氧化碳
28、中毒的唯一检体。其他易挥发毒物样本也要尽量密封保存，尽快检测。如氰化物。,怎么采,样品采集程序 采样用物品准备 采样程序方法 采样纪录 样品编号 样品保存,使用卫生部统一制定的采样记录文书，经有关责任人员签字后送检；,注意,样 品 采 集,影响采样的主要因素,缺乏及时性：由于一些消费者对食品安全法观念淡薄，缺乏自我保护意识，食源性疾病发生后他们不是首先及时向相关部门报告疫情，而是自己先与经营者交涉，在不能如愿的情况下才向卫生监督部门举报，因此造成一是经营者在得知发生食源性疾病的情况后，首先处理掉一切可疑剩余食品，对加工经营现场、工具、容器作了相应的处理；二是延误了报告的时间，从而影响了对可疑食
29、品和病人排泄物的采集。采样缺乏代表性：由于食源性疾病多是突发性的，如细菌性食物中毒都有特定的潜伏期，最短1h 3h，一般5h 10h，但当相关部门接到疫情到达现场后，往往时间周期间隔较长，可疑食物已清理，即使采到几份剩余食物，也可能不是当日餐桌上剩余菜肴，因此，常常出现食品中检出的细菌与病人排泄物中检出的细菌不相符，影响了结果的分析。,影响采样的主要因素,食品加工制作现场各环节的采样往往能提供一些线索，但常常见到现场已被清扫，食具和用具已清洗干净，同样也影响了食品加工工具、容器、场所的采样和检验。采样缺乏典型性：中毒病人发病后，患者一般开始时自行用抗菌毒，严重时才去当地医院治疗，由于一些医务人
30、员对食源性疾病报告制度意识不强，导致了只管用药治疗，忽视了对病人呕吐物和排泄物的留取，大量的抗菌素抑制了致病菌繁殖，从而影响了致病菌的检出率。采样缺乏完整性：一般中毒病人发病期的血液能采集到，但是采集恢复期的血液，由于病人的不配合或外出经常采不全也影响了检验结果的全面分析。,样品的处理,(1)固体食物如系大块鱼肉、组织脏器等，先用烙铁烧灼表面，或在沸水中烫35秒钟，然后再取内部检样510克，按无菌要求，剪碎后置无菌乳钵内，加人适量灭菌海沙研细，再加人无菌生理盐水作1：5稀释，混匀沉淀后，取上清液进行接种和涂片染色镜检。(2)液体食物可将液体食物直接接种培养基，或离心(每分钟3000转以上)半小
31、时后，采取沉淀物进行细菌培养。(3)罐头食品如罐头尚未打开，先用温水洗净表面，并以95酒精燃烧消毒，然后用灭菌开口刀将罐头打开，以无菌操作将检样取出进行细菌检验。如罐头为空盒，可用肉汤培养基冲洗盒内壁，以洗液做细菌培养。,样品的处理,(4)粪便和呕吐物以无菌生理盐水，充分搅拌混匀、静置，待其中粗块下沉后，取上清液进行接种及涂片染色镜检。(5)洗胃液用无菌试管低速离心后，取沉淀物进行检验。(6)血液检样用做细菌培养的抗凝血，以灭菌吸管吸取，注人肉汤或其他培养基内增菌。用于测定患者血清效价的血样，可用离心沉淀法或自然析出法将血清分出，与可疑中毒菌株作试管凝集试验。(7)炊事用具擦洗水等可直接接种培
32、养基。,样本标签内容,样本编号唯一性样本来源从什么物质、材料中采集的，如病理采集的肝脏就可标 注为某某患者肝脏；样本数量包装中样本的数量，如此包装中同时采集了2块肝脏样本 就要标注为2 采样时间：采样地点：采样人：样本处理情况：抗凝剂、运送培养基、标本状况（开封食品）,样本标签内容,最小包装（每个标本）每个包装箱 每批样本后要附上一个样本清单，详细列出此批样本的名称、状态和注意事项。,样品的包装,感染性样本 放射性样本 易腐性样本 挥发性样本,样品的运送,标本应由专业人员专人运送，最好使用专车。邮寄样品除患者检测血浆外，其他样本不宜通过邮寄方式转运。检测血浆用带盖的小塑料管盛装，外衬缓冲包装和
33、吸附材料，通过EMS邮寄。在送邮件时要明确向邮局说明邮寄物品的成分及安全性。在运送过程中，要保证条件能够持续保障。,样品的保存容器、介质、温度,检测目的 细菌 病毒 寄生虫 抗原抗体 核酸 化学毒物预期保存时间,样品的保存运送,安全性 样品的安全 环境的安全（不泄漏、不污染）交接手续,样品送检注意事项,1）采集的样品一般应在4小时内接种完毕，故必须及时送检。2）夏季送检样品时，应注意冷藏。不得加入任何防腐剂。3）应附详细送检单，应填明样品名称、份数、重量、来源、中毒表现、送检时间、有范围的检验项目、采样条件（容器是否灭菌、有无封条）、送样人。4）样品必须有牢固的标签，包装严密封闭。5）注意无菌
34、操作，防止污染，以免影响结果。6）采样过程中履行必要的采样手术。（发生中毒单位负责人签封与开具收据等）7）采集肛拭人数，中毒事件规模较小，患者人数10人以下的，全部采样；中毒事件规模较大，患者人数较多，至少应对30%-50%临床症状典型的患者进行采集。,检 验,检什么,实验项目要结合现场流行病学调查.临床.血检.电生理.影像学检查等结果。确定实验项目应同时考虑以下几点:早期IgM和双份IgG血清学检验；排泄物.分泌物.血液中的病原体的形态学.血清学和核酸分型鉴定。人体外环境病原鉴定结果与人体内抗原、抗体的吻合、匹配；毒力分析和动物实验模型佐证；病原侵入与发病的时间顺序；主导病原与併发病原的甄别
35、;,安排检验项目要有几套预备方案,实验的无果和失败。,检什么,病原分离 细菌需氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌、L型菌 病毒 寄生虫血清学检查：抗原 抗体 急性期IgM抗体 急性期和恢复期双份静脉血测定特异性IgG抗体。核酸检测 特征基因、毒力基因、溯源比较定性/定量,细菌性食物中毒的实验室诊断,致病菌的定量检验对细菌性食物中毒的调查 需要做定量检验的细菌（食物中毒与摄入量有关）产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌、变形杆菌 样品：中毒相关食品、粪便、呕吐物收集致病菌对人的最低感染剂量的资料危险性分析中对暴露量的评估摄入的菌量与产生有害健康作用的概率和程度成正相关，但通常不是呈线性关系。摄入菌量的增加通常降低肠
36、道疾病的潜伏期。,怎么检,灵敏度、准确度、重现性、不同方法结果的可比较性用什么标本用什么方法用什么试剂,对重大事件的毒物鉴定或样本检测要同时送数家具有鉴定检验资质的实验室同步开展工作，避免因实验室管理和技术因素对结果的影响。,检测项目和方法的确定,分析方法的选用要考虑待测样品（原形、代谢物）、分析要求（定性、定量）、样品类型、实验室条件，分析目的等因素，还要考虑时效性、准确性、经济性等要求。有时毒物有定性结果即可说明问题，而对于那些有环境或内源性本底的毒物，或需用于现场评价、应急处理方法选择或用于患者治疗效果评价的要用定量分析。临床治疗药物监测必须进行定量分析。,食品安全国家标准食品微生物学国
37、家检验的演变,怎么检,快速灵敏方法的应用仪器自动化方法分离培养方法的改进,快速灵敏方法的应用,1.细菌培养的前、后处理方法的自动化 培养法的前处理包括采样、称量、分样、匀浆、制作琼脂培养基、样品与培养基混释等。这些操作自动化仪器有：自动称量分注装置、均化器、培养基制作装置、菌液自动涂抹装置等。培养后，进行菌落计数的自动化装置有：笔型手动式计数器、用图像将平板内菌落摄录下来的自动计数仪、彩色图像菌种鉴定仪。,快速灵敏方法的应用,各种简易培养基：简易培养基是食品微生物检验中应用较为普遍的一种快速简便的方法。培养基有印花型、平板型、滤膜型等多种类型。例如，日本几家公司生产的含有酶显色底物的印花型培养
38、基，由于有酶显色底物，因而有快速易判断等特点。液体样品检测用培养基有多种形式，有的在孔板上固定有无菌液体培养基，检测时只要注入液体样品即可判断结果；颗粒状培养基加入液体样品培养即可判断结果；而干燥型培养基是将培养基成分和胶体化物质涂布在培养基垫上，它便于携带，操作简便。,快速灵敏方法的应用,快速灵敏方法的应用,检测活菌数方法与器材 不需进行培养即可直接检测活菌数的方法有：观察细菌引起电流阻抗值变化的阻抗测定法；以细胞内ATP为指标的生物发光法；用荧光剂标记微生物细胞测定发光量的荧光染色法；用滤膜集菌，用ATP发光试剂标记，然后进行测定的滤膜光子检测法等。这些方法是直接检测活菌数，因而适于观察细
39、菌随时问发生的变化，可用于发酵食品的质量管理、饮料生产工艺的监测等。,快速灵敏方法的应用,高选择性显色培养基,食物中毒致病菌简易快速的检测方法与器材,沙门氏菌、O157大肠菌、李斯特菌等食物中毒致病菌如用培养法检测，由于菌量少，需进行前培养和增菌培养，故费时较多，且需熟练的检测技术。因此，近年来国外对食物中毒致病菌简易快速的检测方法与器材的研究十分重视，许多公司纷纷研制出省时、容易判断结果的简易细菌检测方法与器材。目前，已达到实用化程度的快速、简易的细菌检测方法有：应用抗原体反应原理的免疫凝集法、免疫沉降法、免疫荧光法、EIA法，免疫色谱法、以及磁珠法等，DNA探针法，PCR法。,分子生物学技
40、术在检测食源性病原微生物中的应用,DNA探针技术 DNA探针技术是最新发展起来的一项特异、灵敏、快速的检测方法，但因有一定比例的假阳性反应，故所有阳性结果必须用标准的培养方法加以确证。聚合酶链反应(PCR)技术 PCR技术原理为提高DNA探针的敏感性，可先将靶 DNA序列扩增，增加 DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。在PCR反应中引人Taq聚合酶使反应得以半自动化和简便反应程序。用扩增DNA进行的PCR反应具有无与伦比的优越性。,快速检出细菌的毒素,自临床标本中直接检出细菌的毒素，常比细菌培养更可靠。如难辨梭菌在正常肠道中也可出现，故对抗生素相关性肠炎的诊断
41、，检出其毒素比细菌培养更有意义。已应用此类毒素的单抗以快速凝集或EIA法自粪便标本中直接检出毒素A或B进行诊断。产毒素埃希氏菌（ETEC）感染的诊断主要依靠检查细菌的LT（热敏毒素）与ST（耐热毒素）可应用其单抗以多种免疫学手段检出。肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）的重要特征是产生Vero细胞毒素（VT）或称志贺样毒素（SLT）。由于EHEC的血清型繁多，生化反应也可不典型，故检查该菌的毒素极具诊断价值。,快速检出细菌的毒素,英国Unipaih公司已研制出VTEC的PRLA乳胶凝集试剂分别检查VT-1与VT-2，试验时以多粘菌素裂解菌体，释出VT，与乳胶试剂在U形板中温育24小时，肉眼判定有无
42、凝集。日本生研公司的VIEC-RPLA也为快速凝集试剂。Bentin等注意到90%的VTEC在洗过的羊血肉汤平板上经37温育过夜可表现出溶血；而非溶血菌落均无VT或SLT基因。这一发现为VTEC的检测提供一迅速的筛查方法。金黄色葡萄球菌产生的多种肠毒素也用单抗的协同凝集试验迅速检出，是诊断该菌致成的事物中毒的可靠手段。应用反向被动乳胶凝集法（Oxoid公司试剂）快速检测葡萄球菌的TSST1，可及时诊断出由葡萄球菌致成的中毒性休克综合征。,快速的细菌对抗菌药物的敏感性试验,新的检测手段，如分子生物学手段检测细菌的耐药基因，自动化的药敏试验仪器，E test法等可提高准确性与效率。快速纸片法（Ni
43、trocefin）检查内酰胺酶，对革兰阳性球菌，淋病奈瑟菌，流感嗜血杆菌，卡他莫拉菌有重要意义。快速乳胶凝集试验（日本生研公司）可检出变异的青霉素结合蛋白（PBP2a）经与mecA基因检测比较，其敏感性98.5%，特异性达100%。,细菌性食物中毒样品检验程序,1 样品采集 以无菌容器采集可疑样品及病人的排泄物。2分离培养 在病原菌不明确的情况下，多准备一些各类菌的选择性培养基，如ss平板，伊红美兰平板作沙门菌、志贺菌；血平板、P-K琼脂平板作金黄色葡萄球菌分离用；氯化钠蔗糖琼脂或TCBS琼脂作副溶血性弧菌及溶藻性弧菌用；甘露醇卵黄多粘菌素琼脂作蜡样芽孢杆菌分离用等等。接种：取适量可疑样品放置
44、无菌平皿中，加入与样品等量的无菌生理盐水，将样品与生理盐水充分混匀，用取菌环分别接种于各种平板培养基上，置37 培养20h左右，观察各平皿菌落特征，进一步鉴定。,细菌性食物中毒样品检验程序,3.取优势菌株进行系统鉴定 对优势菌株进行涂片镜检，革兰染色，以形态特征、菌落特点做出意向性判断进行下步鉴定，接种克氏双糖含铁琼脂培养，然后做血清凝集，生化实验，毒性实验等，报结果 4.活菌数的测定某些细菌在食品中须达到一定量时才可引起中毒症状(如金黄色 葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、产气荚膜梭菌等)。方法是取样品的各个稀释液（包括1:10）0.1mL接种2只相应的平板，用灭菌玻璃棒在每只平板表面涂布均匀。将平板
45、置30培养24小时，数出可疑菌落数，然后挑取典型菌落5个或更多的可疑菌落，经过证实试验后，计算出菌落数。,细菌性食物中毒样品检验程序,5.毒素测定 有些细菌性食物中毒并不是细菌本身所引起，而是由其所产生的毒素引起的，如金黄色葡萄球菌肠毒素、肉毒梭菌毒素，故须做其毒素的测定。动物试验将可疑食物制备浸出液，或分离所得的上清液，皮下或腹腔注射动物(小白鼠)体内，观察数日，看有无中毒。,细菌性食物中毒样品检验程序,6.血清凝集试验 将中毒患者急性期和恢复期的血清，与自中毒检样中分离的致病菌所制成的菌体抗原(将分离菌接种培养基，37培养24小时，待其生长旺盛后，刮取菌苔至灭菌盐水中，混散均匀，用生理盐水
46、稀释成6亿，毫升即成)做试管凝集试验，观察凝集价有无上升趋势，如恢复期的血清效价比发病初期有明显增高（增高4倍或以上）即有诊断价值。,经验,1.对所有样品进行致病菌分离和鉴定时应按照国家标准检验方法和已公认的微生物检验程序，应用直接分离及增菌双重培养，直接分离可检出样品中的优势菌(包括一些条件致病菌)增菌可将样品中污染的但又菌量较少的病原菌捡出，同时对服药患者肛试样品中被抗菌素抑制的细菌达到复苏和增加菌量帕作用 2.由于多种病原菌引起的食物中毒，有相类似的临床症状，因此对致病菌的检测范围应扩大，在分离培养时应多准备一些各类菌的选择性培养基，采取多思路、多方法同时检测各种致病菌的原则，从而获得满
47、意的检验结果。,经验,金黄色葡萄球菌按GB47892010(以下简称GB)的方法有时不能检出。有一次食物中毒检验中我们同时用GB的方法和法国梅里埃公司生产的血浆凝固酶平板的方法，结果GB的方法没有检出，而血浆凝固酶平板的方法却检出了金黄色葡萄球菌，看来多种检验方法并用能提高致病菌的检出率。2 副溶血性弧菌食物中毒中最多见的一种致病菌。按GB方法样品经增菌后划TCBS平板，经1824 h培养后菌落有时为不典型的黄色或黄绿色，继续培养24 h后菌落才成典型的蓝绿色，经生化鉴定符合副溶血性弧菌。这是因为溶藻性弧菌呈优势菌时，会影响副溶血性弧菌的菌落颜色。所以经24 h培养，菌落不典型时不要轻易放弃，
48、应继续培养24 h后再作鉴定。我们在培养副溶血性弧菌时已多次出现这种情况。,经验,3 沙门菌也是较常见的一种致病菌。,结果的报告、解释、分析,结果的报告、解释、分析,实验室检测结果是确定病因的重要依据，但实验室结果要和现场调查情况、患者的临床表现一起分析，才能确定病因。检验结果的正确性不仅取决于实验室的条件和技术水平，同时还与检验样品的采集、保存、送样方法等方面有关。因此在分析检验结果时，除了应考虑结果是否符合有关实验室判定标准外，还应综合考虑各种困难影响检验结果的因素。阳性结果不一定能说明病原因子在爆发事件中的致病作用；反之阴性结果也不一定能完全否定某种病原因子的病因假设,细菌性食物中毒的实
49、验室诊断,要点：从相关食品及发病者中分离到相同的致病菌从同批发病者中分离到相同的致病菌从食品中分离到致病菌的致病特点与发病者的临床症状相符,检出限值和检验结果的表达,每个实验室对已经建立的检测方法都要进行准确性和灵敏性评价，还要争取开展与其它检测方法之间进行比较的工作。每批样本都要对方法进行检出限值（最低检出浓度）测算，并将最低检出限值在发出的检测报告中注明。对定量检测，如样本中毒物浓度超过检出限值，应标注出实际测出的数值；如在样本中检测出所检测的毒物，但毒物的量（或浓度）低于检出限值，应在检测报告中报告“检出”；对在样本中未发现目标毒物，应该检测报告上注明“未检出”。对定性检测，样本中检出目
50、标毒物时在检验报告上注明“阳性”；对未检出目标毒物者在检验报告上注明“阴性”。,结合流调资料分析检测结果,冲突结果的处理,每个重大中毒事件病因确定或中毒患者诊断的过程中都会有一次或多次毒物鉴定检测，各次检测结果应该有一致性，这些结果共同指向某一种（或多种）毒物。冲突的原因分析a.检测方法、所用的仪器不同，其灵敏度、精确度不同，每种方法都有其局限性。一种方法能够检出的另外一种方法可能检不出。b.每个实验室采用的实验方法不同，包括样本前处理、实验条件等对结果也有影响。c.用于分析的样本是来自不同的个体、材料、位置及同一不均匀样本的不同部位，这些都带来不同的分析结果。d.样本采集、运输、实验室操作过
