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1、第三节 基因工程载体（vector）,能将目的基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的遗传因子谓之为基因工程载体,相关概念,有用基因亦称为目的基因或插入物用于接受重组DNA的扩增载体及其插入物或表达目的基因的受体细胞谓之宿主插入物的扩增过程称为分子克隆携带重组DNA分子的宿主为基因工程细胞（菌）或重组细胞（菌）,基因工程载体的必备条件,1、具有有效运载能力2、携带外源性目的基因前后在宿主内功能自主复制3、在宿主内能控制外源基因表达活动4、鉴定方便，装卸手续简单5、能携带大小不同的外源性目的基因、载体分子量要小,载力要大6、容易控制、安全可靠、稳定性好,三大类基因工程载体,细菌质粒 病 毒DNA
2、基因真核表达 植物表达（烟草花叶病毒）动物表达（腺病毒）噬菌体DNA,一、细菌质粒,、质粒的生物学性质,细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传物质。绝大多数的质粒都是由环形双链DNA组成的复制子。（现发现有线性质粒，酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒）,环形双链质粒分子具有三种不同构型,1、共价闭合环形DNA（SCDNA）：两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构;2、开环DNA（OCDNA）：两条链中只有一条保持完整环形结构，另一条链出现一至数个缺口;3、线性分子DNA（LDNA）通称L构型：质粒DNA经过适当的核酸内切酶切割后，发生双链断裂而形成;,以上三种不同的构型的同一种质
3、粒，尽管分子量相同，但在琼脂糖凝胶电泳中，电泳迁移率不同，顺序是SCDNA、LDNA、OCDNA,质粒的生物学性质,分子量小，差异显著，小的分子量为106dal,大的可达108dal。易于在宿主间转移和迁移。在宿主内可伴随宿主染色体复制而复制，与宿主呈共生关系。且其存在与否与宿主生死无关。编码宿主染色体不具有的基因，赋予宿主细胞额外遗传特性（如抗生素抗性）,、质粒的分类,迄今为止，人们已在大肠杆菌的各种菌株中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了较详尽研究，了解比较透彻的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。由于这些质粒的存在，寄主细胞便获得了各自不同的性状特征，我们可以依据这些特征来鉴别这三种
4、不同类型的质粒。,1、F质粒 又叫F因子(fertility factor)或性质粒(sex plasmid),这是由于它能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道 转移到原先不存在该质粒的受体胞中去而得名。是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种具有代表性的单 拷贝的接合型质粒，其大小约为 94kb左右，总共编码 19个转移基因（tra)。,在寄主中，F质粒有三种不同的存在方式,1、以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有 任何来自寄主染色体的基因或DNA区段。这样的细胞 叫F+细胞2、以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上 还携带着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞 叫F细胞3、
5、以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上，这 样的细胞叫做Hfr(High frequential recomhimant)高频重组细胞,2、R质粒,通称抗药性因子。在其结构中编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。,3、Col质粒,即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等,非接合型质
6、粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其他成员,F因子属接合型质粒，而Col质粒和R质粒中，既有属于接合型的，也有属于非接合型的。从基因工程的角度考虑，感兴趣的主要是非接合型质粒，这是因为接合型的质粒不仅能够自我从一个细胞转移到另一细胞，而是还能够转移染色体记号。因此，如果使用接合型质粒作载体，在理论上存在着发生使DNA跨越生物种间遗传屏障的潜在危险性。,、重要的质粒载体,目前常用于基因克隆的质粒载体均为人工构建。经改造后达到这些要求：其分子结构中必须具有多个单一限制酶切割位点，且切点最好位于选择性标记上构建重组质粒后必须具有转化功能最好带有两个以上强选择性标记分子量较小，为松弛
7、型复制控制，易于操作宿主范围小，无感染性，不受其他质粒诱动。,1、Col E1质粒载体 Col E1质粒属大肠杆菌Col类质粒中的一种，由于携 带Col质粒的许多细菌都能产生一类叫做细菌素的物 质，故Col质粒又被称作细菌素质粒。,总结：分子量4.2106dal，携带Col质粒的许多菌能产生细菌素 Col E1 编码大肠杆菌素E1基因和大肠杆菌素E1 免疫基因。有单一EcoR切点，切开接入外源 基因后，虽失去大肠杆菌素E1能力，但却不影 响DNA复制能力属松弛型复制，多拷贝，拷贝数可大1000-3000,2、pSC101质粒载体 pSC101是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌 质粒载体，
8、平均每个寄主细胞仅有1-2个拷贝。其分子大小为9.09kb，编码一个四环素抗性基因(tetr),该质粒对EcoR、Hind、BamH、Sal、Xho、Pvu和Sma等7种限制酶有单一识别位点。其中Hind、BamH和Sal等3个位点克隆外源DNA 都会使tetr失活。（插入失活效应）,pSC101质粒载体性质：严紧型复制控制 低拷贝 1-2个拷贝/细胞9.09kb 编码一个tetr，有EcoR、Hind、BamH等7个 酶切单一位点，可插入失活。缺点：低拷贝，表达效率低。pSC101是第一个成为用于克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体，1973年成功地将带有非洲爪蟾核糖体基因的EcoRI DNA片
9、段，连接到pSC101复制子上。,应用pSC101质粒载体在大肠杆菌细胞中克隆非洲爪蟾的基因,3、pBR322 是一种人工构建的重要质粒 特点：带有多种抗药性的强选择记号 具有低分子量，高拷贝 外源DNA插入不影响复制功能 有多种核酸内切限制酶单切割位点优点：自身分子量小 4363bp 同时具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号 具有较高的拷贝数,普通型载体pBR322的结构图,pBR322由三个不同的部分组成,1、来源于pSF2124质粒易位子Tn3的ampr2、来源于pSC101质粒的tetr3、来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点,4、pUC质粒载体,pUC质粒是在p
10、BR322载体质粒的基础上，组入了一个在其5端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。,pUC取名是根据它们的加州大学(University of California)的科学家J.Messing和J.Vieria于1987年首先构建的,(1)pUC质粒载体的结构,pUC系列质粒载体包括以下四个组成部分：来自pBR322质粒的复制起点ori）；氨苄青霉素抗性基因Ampr，但它的DNA中核苷酸序列已发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点；大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列，此结构称为lacZ基因；位于lacZ
11、基因中的靠近5端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。,pUC18/19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,5-溴-4-氯靛蓝（蓝色）,476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表达半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。lacZ之内有M13的多功能连接器多克隆位点（MCS）。,(2)pUC质粒载体的优点,具有更小的分子量(2686bp)和更高的拷贝数(500700)适用于组织化学方法
12、检测重组体具有多克隆位点MCS区段，可以更方便的插入外源基因,二、噬菌体载体和柯斯载体(cosmid)及单链DNA噬菌体载体(M13),(一)噬菌体DNA,1、噬菌体的结构和性质,噬菌体为双链DNA病毒，宿主为E.Coli。在宿主内有溶菌和溶源两种形式，在溶源方式中，噬菌体感染宿主后其DNA整合到宿主染色体DNA中，伴随宿主染色体复制而复制。,噬菌体DNA是有48502bp组成的线性双螺旋分子，分子量3.1107dal。迄今已定位的基因至少61个，其中一半参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为噬菌体的“必要基因”；另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类
13、基因为噬菌体的“非必要基因”。这为其作为基因工程噬菌体载体的基础。,野生型的噬菌体DNA两端各具12个核苷酸组成的粘性末端，可用来构建柯斯质粒（cosmid）。,l 噬菌体生物学特性：生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,2、噬菌体DNA克隆载体,野生型的DNA不适宜作为克隆载体。因为其分子量较大，常用的限制酶切点较多。如EcoRI切点5个，Hind切点7个，而这些切点大多位于溶菌周
14、期生长所必须基因内，容纳不下比其更大的外源性DNA片段，必须对其进行改造。,改造方法：,将噬菌体感染到具有EcoR I限制修饰体系的和不具有EcoR I 限制修饰体系的两种寄主细胞中循环生长，使DNA 的EcoR I 位点发生修饰作用或产生点突变，使其一些EcoR I 位点不能再被EcoR I 切割。最终筛选获得仅有1-2个限制酶位点的DNA。将DNA在体外用限制酶消化，再将未切割部分包装并感染E.Coli。如野生型DNA 上有7个Hind限制位点，从图中可看出，E.Coli位点1 和2之间片段的缺失，可降解去两个Hind位点1和2。,按此上方法，可构建两类噬菌体派生载体,取代型载体或替换型载
15、体（replacement vector）它具有成对的克隆位点，这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。如EMBL4和Charon40。(图5-12),插入型载体（insertion vectors）只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点（也有一些具有两个插入位点）。外源性DNA克隆到插入型的载体分子上会使噬菌体的某中生物功能丧失，即所谓插入失活效应。如免疫功能失活的和大肠杆菌-半乳糖苷酶失活的两种亚型。,许多Charon载体带有编码-半乳糖苷酶基因以及它的操控基因和启动子的lac 5取代区段，如Charon 4噬菌体可以在Xgal琼脂培养基上产生出深蓝色的噬菌斑。而当含有
16、lac 5的EcoRI片段被外源DNA取代后，所形成的重组噬菌体就只能产生出无色的噬菌斑，可以很方便的进行重组体筛选。（图5-13）,凯伦噬菌体载体（Charon bacteriophage）,我们把这些经过改造的噬菌体载体称为：,是等人于1977年在噬菌体基础上发展出来的一种特殊的噬菌体载体。这类载体有插入型的如Charon2,亦有替换型的如Charon30。他们在基因工程实验中用途十分广泛。,载体遗传标记检测,显色筛选法,显色筛选法的基本操作：,Ap,r,lacZ,ori,Ap+X-gal,重组子（Apr+lacZ-）,将外源基因克隆在Charon噬菌体载体的lacZ标记基因内部，使之灭活
17、，此时重组子呈Apr、lacZ-，清亮噬菌斑；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色噬菌斑,3、DNA载体重组分子的体外包装,以噬菌体DNA为载体构成的重组DNA分子必须包装成完整病毒颗粒后才具有感染宿主的能力。,噬菌体的正常包装过程1、先按滚环复制合成多连体的DNA，2、这些DNA 在具备噬菌体头部前体和A基因产物的条件下，从cos位点处被切割成DNA 单体分子，并被很快装填到头部外壳里边，3、它具有的12bp长的粘性末端，又会重新环化起来，4、基因产物便渗入到完整的头部，接着通过基因W和基因F II产物的作用，把头部与尾部结构连成一体，最终形成成熟的噬菌体颗粒。,体外包装过程利用两个琥珀突
18、变种噬菌体，一个是Dam 噬菌体，产生头部蛋白。另一个是噬菌体Eam突变体产生尾部蛋白。上述溶菌物与重组DNA混合后，基因E产物（主要为外壳蛋白）在基因A产物作用下，与基因D产物一起将重组DNA包装成噬菌体头部，在基因W及基因F产物作用下，将头部和尾部连接成完整噬菌体颗粒。,特点：经包装后重组DNA分子转化率提高100-1000倍。这类载体可以有效克隆15kb大小的外源基因。,(二)科斯质粒载体（Cosmid vectors）,1、概述,噬菌体一般有效克隆外源基因范围仅为15kb左右，但有些基因可达35-40kb，甚至更大，同时噬菌体不能够同时克隆两个连锁基因。为此，1978年，J.Clooi
19、ns及B.Hohn等人发展出科斯质粒载体，可满足以上需要。“cosmid”一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成，其原意是指带有粘性末端位点(cos)的质粒。,2、Cosmid的特点,目前已有许多不同类型的科斯质粒载体，其特点如下：具有噬菌体的特性；具有质粒载体特性；具有高容量的克隆能力；具有与同源序列的质粒进行重组的能力。,3、科斯克隆,先用特定的核酸内切酶局部切割真核生物DNA，产生较高分子量的外源DNA片段，与经同样酶切割过的科斯质粒线性分子进行体外连接反应，由此形成的连接产物群体中，有一定比例的分子是两端各有一个cos位点的长度为40kb左右的真核D
20、NA片段，而且这两个cos为点在取向上是一致的，它可作为Ter体系的一种通用底物。当加入噬菌体的包装连接物时，它将能识别并切割这种两端由 cos 位点包围着的35-45 kb长的真核DNA片段，并把这些分子包装进入噬菌体的头部。（图5-19）,(三)单链DNA噬菌体M13载体,1、概述 噬菌体M13宿主为丝状E.Coli，其遗传物质为单 链环状DNA，故称为单链DNA噬菌体。其DNA分子长度为6500bp。M13是一种雄性大肠杆菌特有的噬菌体，因此它们只能感染带有F性须的大肠杆菌菌株。其复制过程如下：,M13噬菌体的生物学特性：感染周期,（+）DNA,RFDNA,RFDNA,RFDNA,-DN
21、A,II,V,2、M13克隆体系中半乳糖苷酶显色反应,M13克隆体系，包括M13噬菌体本身和寄主菌株两个组成部分。但无论M13载体，还是大肠杆菌寄主菌株（如JM101），单独都不能产生有功能活性的半乳糖苷酶，而这种酶的活性可以用X-gal显色法测定出来。,在M13体系中，已将Lac阻遏基因的Iq突变引入宿主细胞。该Iq突变基因可产生出10余倍超量的阻遏物。这些阻遏物的存在可以抑制Lac操纵子的表达。IPTG是一种乳糖类似物，再无乳糖的条件下，他可以诱导细胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG被称为半乳糖苷酶的安慰诱导物。,安慰诱导剂,3、M13载体系列的优点 单链DNA噬菌体的复制是以双链环形DNA
22、为中 间媒介的，这种RFDNA可以如同质粒DNA一样，在体外进行纯化和操作。不论是RFDNA还是ssDNA，它们都能够转染感 受态的E.Coli寄主细胞产生出噬菌斑 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多寡 的制约，因此，并不存在包装限制。,应用这类单链DNA噬菌体，可以容易地控制外 源DNA片段的插入取向。可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链 DNA分子。这种单链DNA分子可按双脱氧链终 止法做核苷酸序列测定，也可用于制备具放射 性同位素标记的DNA探针，可以进行寡核苷酸 定点突变。总之，M13载体兼具质粒载体与噬菌体的优点。,采用Sanger双脱氧链终止DNA测序法：测序三要素：
23、1、模板DNA母链。新合成链按碱基互补原则（A-T，C-G）进行。2、引物DNA短链。起起始合成作用。3、酶、底物（dATP、dTTP、dGTP、dCTP)和非正常底物（ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP)。,DNA序列测定法,三、真核基因病毒载体,病毒载体优点是：1、有很高的拷贝数；2、强大的启动子，可保证外源基因的高效表达；3、可保证糖基化。常用的有SV40病毒载体及昆虫杆状病毒载体。,真核基因表达载体应具备的条件：1、含有原核基因的复制起始序列（如ColEI起始序列ori）以及筛选标记（如使E.Coli具有Ampr的-内酰胺酶基因）。这样便于在E.Coli细胞中进行扩增和筛选
24、。2、含有真核基因的复制起始序列（如SV40病毒的复制序列、酵母自主复制序列）以及真核细胞筛选标记（如氨基糖苷G418抗性基因，在酵母中与自养有关的基因）。,3、含有有效的启动子序列（可包含增强子序列等各种顺式作用元件cis-acting element），保证在其下游的外源基因进行有效的转录起始。4、RNA聚合酶II所需的转录终止和poly(A)加入的信号序列。5、合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。,SV40病毒载体(simian vacuolating virus 40 vector)SV40病毒DNA位环状双螺旋结构，长度为5224bp，其基因组分为早期区域和晚期区域，前者在整个病
25、毒生长循环中均可表达，后者则在DNA复制开始后的一段时间内表达，产生病毒外壳蛋白。,pV2(gpt)即为一个SV40载体它包括pBR322的大肠杆菌复制起始位点；氨苄青霉素抗性基因；大肠杆菌谷丙转氨酶基因gpt和SV40的哺乳动物细胞复制起始位点以及其他一些在哺乳动物细胞中表达所必须的序列。重组子可以通过对gpt进行筛选。,利用SV40载体生产外源蛋白过程的示意图:,SV40 DNA为载体的取代克隆方式又分为早期基因区域取代及晚期基因区域取代两种类型。晚期基因区域取代方式是以外源性DNA片段取代晚期基因区域，构成的重组DNA在宿主中可以复制，但不能产生重组病毒颗粒，因而采用早期基因缺失的SV40病毒突变种作为辅助病毒与晚期取代重组DNA或和感染宿主，则晚期区域取代重组DNA可获得标记营救，辅助病毒产生的晚期基因产物与重组病毒的早期基因产物一起可形成完整病毒颗粒。早期区域取代方式是以外源性DNA片段取代早期基因区域，但重组DNA形成病毒颗粒与早期区域基因产物T抗原供应有关，故同样可采用晚期基因区域缺失的SV40突变种作为辅助病毒进行标记营救，即可形成完整病毒颗粒。,SV40病毒载体的宿主为动物细胞。表达产物有糖基化。目前很多基因工程药物如EPO，TPA，-珠蛋白及抗体药物可用其表达。,
