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1、Chapter 8 PCR technology,PCR polymerase chain reaction,Another cloning methodSelective amplification of a DNA sequence.In some situation,it essentially replaces traditional cloning methodology.,PCR principlePCR:A technique to selectively amplify a specific region of DNA.A method like DNA replication
2、 in vivo.template：ssDNA or dsDNAprimers：oligo-nucleotidessubstrates:dNTPDNA polymerase:Taq poly,Basic principle：DNA thynthesing template/primer/DNA poly Application:themal-resistance DNA polymerase,DNA amplification Principle,dATP dGTP dCTP dTTP,Mg2+,buffer,53,35,template,primer,DNA polymerase,denat
3、ure,annealing,extension,dsDNA ssDAN,92-96C,37-72 C,50-58 C,72 C,3Reaction,PCR reaction mixture1缓冲液 buffer(1)50Mm(大于500bp)(70-100Mm,小于500bp)KCl 引物退火 annealing 10mM TrisHCl 1.5mM MgCl2(0.5-2.5)Stored in 20,2.dNTP Final concentration 0.2mM(即饱和浓度)pH7.0(浓度大于4mM可能抑制扩增反应)4种dNTP 应平衡，提高忠实性 使用时应考虑Mg2+,引物，产量之间
4、的关系 如序列分析和制备探针时，用20-40m,3.Primers(正反向、同源互补、正反义)Each 1m(1pmol/l)OD260 dsDNA 50g/ml ssDNA 40g/ml oligo 33g/mlPrimer design 16bp,frequently 20-30bp Tm=81.5+16.61ogJ+0.41(G+C)%-(675/N)N:length of strand J:concentration of monovalent ion If N=20 G+C%=55%J+=60mmol/L then Tm=81.5-20.3+22.6-33.75=50.05,Tm=(
5、G+C)4+(A+T)2 for short primers,Operon 公司http:/,避免二级结构的形成 二聚体 二级结构 G/C和A/T分布尽量均匀,一般G+C%45-55%oligo dT/oligo dC 除外，其它，如5末端，限制酶位点的长度 rondom primers 随机引物 6nt 10-12nt,4.Templateg or ng 102-1051g 人类单拷贝基因组DNA 3105 targets10ng yeast DNA 31051ng E.coli DNA 31051ng 1kb DNA 9 1061%M13 plaque 106,5.DNA polymera
6、se 1-2U 早期使用klenow(1)Taq DNA polymerase,75,94kDaThermus aquticus 嗜热水生菌，水生栖热菌 5-3polymeration and 5-3 exonuclease,Taq half-time 2hr 92.5 40min 95 5min 97.5,(2)Tth DNA polymeraseThermus thermophilus HB8,94kDa,Mg2+:5-3合成DNAMn2+:以RNA为模板合成cDNA可解决RNA反转录过程中形成的二级结构反转录:primer extension,cDNA合成,(3)DNA polymera
7、se with 3-5exonuclease and themal-resistanceA.Vent DNA poly(New England Blabs)Thermococcus litoralis,85kDa Half-life:1.8hr at 100(使用MgSO4)but Taq 5min,B.Tli DNA poly(Promega)85kDa 来源同VentCPwoPyrococcus woesei(BM-Roche)90kDaHalf-life 2hr at 100 5min for TaqD.PfuPyrococcus furiosus 激烈热球菌（stratagene）E.
8、商用混合酶,pfu Ideal for high-fidelity amplification Lowest error rate of any thermostable DNA polymerase studiedOne of the most thermostable DNA polymerases known Lack of extendase activity means no unwanted 3 overhangs Optimal for blunt-end PCR cloning Optimum temperature near 75C 95%active after 1-hou
9、r incubation at 98C Native and recombinant versions available,PCR reaction program1.Frequently program94-96 预加热 10-几分钟/加酶 94 30”55 30”72 1 72 3-7min 4,2Annealing temprature（退火温度）Tm-5 特异性高，需高温If high Tm(55-72)，using two-step method37 for rondom primers,3TimeDenature 30”若G+C高可长，若为Cell可长Renature 30”(20
10、”-40”)Extention 1min 1kb 55 24nt/sec 37 1.5nt/sec 72 500bp-20sec,1.2kb-40sec if secondary structure,longer time,Other:after 10 cycles，increasing time for each extention 10”,30”,or 1,4cycles2535 Targets(起始模板)required cycles 3105 2530(1ug 哺乳动物DNA)1.5104 3035 1103 3540 50 4045,Nf=N0(1+Y)n,N0:original c
11、opies，Nf:final copies，Y:extention efficiency，N:cyclesIf Nf=1012,Y=70%,N0=3105,then n=28.6,Plateau effect平台效应在PCR反应后期,产物的积累按减弱的指数速率增长(一般已积累到0.31pmol产物)原因:底物浓度降低，dNTP or Primers dNTP or enzyme的稳定性 末端产物抑制(pyrophosphate焦磷酸,dsDNA)非特异性竞争(非特异性产物or primer-dimer)特异性产自身复性(10-8M)高浓度产物下,变性不彻底.,5Preparation of r
12、eaction solution(1)常规 最后加酶,及矿物油(2)具3-5活性酶A:template,primer,dNTP H2OB:buf,enzyme,H2O(3)热起始 hot start下层:dNTP buf primer中间:蜡珠(Ampli Wax PCR Qam100)上层:template(Taq)先加下层液,再一粒蜡株,70 10min 5 5min迅速加30l上层混合物,Application of PCR in gene cloningAdding RE sites1.Primer designing(引入酶切位点）切点的类型 A 5：8 base序列，其中3-4为附
13、加,4-6为酶切点，增加 引物 长度，但酶切效果仍然不好。B 若内部序列为已知,则根据需要，可进行5端突变设计，效果更好切点的位置 参见限制性内切酶部分 如EcoRI,5端有一个C,在 2hr内可切割90%HindIII 5端有3个C,在 2hr内可切割10%20hr内可切割75%,Vector-T Taq酶特性：在平端双链DNA的3端添加1个A T载体：5端有1个T 效果好Blunt-end ligation 用Klenow大片段或T4 DNA聚合酶消去3端的突出 碱基，获得平端PCR产物,Development of PCR（1）Nest PCR,1st2nd,（2）A/T cloning
14、 PCR产物：Taq poly 产物的3末端 一般要在3末端加一个核苷酸,通常为A 载体 pGEM-T,pGEM-T Easy(promega)pCR-3,pCR-II,pCR-3-Uni(半磷酸化)(Invitrogen)核心 线性DNA,(3)反向PCR(inverse PCR),“正向”,“反向”,(4)长片段的PCR克隆,pH值变化，缓冲能力变化，以及锰离子的促裂解，模板和产物DNA被损坏；过长的分子变性困难；聚合酶与模板结合难；错误率增加，错误的碱基反过来导致聚合酶的失灵,多用混合酶(如Pwo,Pfu)来扩增,Taq Pwo Long sys,0.9kb 1.1kb 2.9 4.8
15、6.3,科学出版社 C.W.迪芬巴赫/G.S德维克斯勒，1998CW,（5）PCR-mediated mutaginesis(诱变)PCR随机突变每循环Taq错配率在0.1210-4之间。20-25环后，每个核苷酸产生的累积错误率达10-3,但对于构建一个不同序列的变异库仍然不够，特别是1kb的片段。原因：普通条件下具较大定向错配即AT对变GC对。设计出一种致突变PCR法，使错误率达710-3，且无倾向性。,Mg2+7mM Mn2+0.5mM 提高dCTT/dTTT到1M，促进错误掺入 提高Taq酶量，促进延伸链在碱基错配位 置继续延伸,PCR定点诱变见“定点诱变”章节,（6）PCR dete
16、ction and diognosis,普通诊断以一对引物或几对引物，加以对照，检测样品中的DNA的存在 医疗，商品，法医等位基因鉴定若多个相似基因共存，设计一系列引物对其进行鉴定，如 Bt crystal protein genes,(7)Molecular markers RAPD 随机扩增多态性DNA Random amplified polymorphic DNA AFLP 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism SSR simple sequence repeat 又称 微卫星DNA（Microsatellite DNA）短串联重复序列（Short tandem repeats,STR）,(8)RT-PCR 反转录酶PCR reverse transcriptase PCR mRNA-first strand of cDNA 随机引物，如6碱基成对引物，单个18碱基引物(cDNA合成，单一引物）,(10)PCR sequencing,(9)Restriction-site PCR For gene walking,
