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1、授课教师：田宝玉,基因工程Genetic Engineering,切,接,转,增,检,基因工程内容和步骤,基因克隆和DNA分析（第5版）,第一部分 基因克隆和DNA分析的基本原理第1章 为什么说基因克隆与DNA分析非常重要第2章 基因克隆的载体质粒和噬菌体第3章 从活细胞中纯化DNA第4章 DNA纯化后的利用第5章 将DNA引入活细胞第6章 大肠杆菌的克隆载体第7章 真核生物的克隆载体第8章 怎样获得特定基因的克隆第9章 聚合酶链反应（PCR）第二部分 基因克隆和DNA分析在研究中的应用第10章 基因的位置和结构的研究第11章 基因表达和功能的研究第12章 基因组研究第三部分 基因克隆和DNA
2、分析在生物技术中的应用第13章 克隆基因的表达第14章 基因克隆和DNA分析在医学中的应用第15章 基因克隆和DNA分析在农业中的应用第16章 基因克隆和DNA分析在法医学和考古学中的应用,第4章 DNA纯化后的利用,DNA操作酶,DNA连接酶,DNA限制性内切酶,4.1 DNA操作酶的范围,核酸酶（nuclease）,连接酶（ligase）,聚合酶（polymerase）,修饰酶（modifying enzyme）,拓扑异构酶（topoisomerase）,其它,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶,定义：打断DNA链中连接相邻核苷酸的磷酸二酯键,4.
3、1 DNA操作酶的范围,4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶,分类：外切核酸酶和内切核酸酶,从DNA分子的末端一个一个地切除核苷酸链,在一个DNA分子内部打开磷酸二酯键,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶,外切核酸酶（单链或双链切割）-Bal31,Bal31：同时对DNA分子的双链末端一个一个地切除核苷酸链,越来越短,单核苷酸,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶,外切核酸酶（单链或双链切割）-核酸外切酶,核酸外切酶：可以从DNA双链中一条链的3 末端一个一个地切除核苷酸链,产物：单链DNA分子（不能
4、作用于单链分子）,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶,内切核酸酶（单链或双链切割）-S1核酸酶,S1核酸酶：催化单链DNA分子降解成为5单核苷酸作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶,内切核酸酶（单链或双链切割）-DNase,DNase（脱氧核糖核酸酶）：打开DNA分子内部任意的磷酸二酯键（包括单链和双链）产物为单核苷酸与寡核苷酸或单核苷酸（可以用在RNA提取中去除DNA）,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.1 核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶,内切核酸酶（单
5、链或双链切割）-限制性内切酶,限制性内切酶：能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶,基因工程中主要工具酶-一把特殊的剪刀,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.2 连接酶：将两个核酸分子连接起来的酶,DNA连接酶,DNA连接酶（ligase）：在一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在2条DNA链之间形成的磷酸二酯键,4.1 DNA操作酶的范围,缺口（nick）,裂口（gap）,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.3 聚合酶：复制核酸分子的酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶：
6、能够合成一条与一直模板DNA或者RNA互补的新DNA双链要素：模版和引物,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.3 聚合酶：复制核酸分子的酶,种类很多，基因工程中常用到四种（1）DNA聚合酶（大肠杆菌）,DNA聚合酶：当DNA双链分子中存在一个单链缺口时，DNA聚合酶与单链区域结合，合成一条新链，替换并降解原来存在的那段DNA具备DNA合成和水解双重酶活性,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.3 聚合酶：复制核酸分子的酶,（2）Klenow片段（DNA聚合酶一部分）,DNA聚合酶的合成酶活性和水解酶活性是由酶分子的不同部分控制，其中酶分子前段325个氨基酸具有水解酶活性，切掉这一部分后，剩下的部
7、分则只具有聚合酶活性，剩下的DNA聚合酶片段称为Klenow片段，在基因工程中可以用来补缺口,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.3 聚合酶：复制核酸分子的酶,（3）Taq DNA聚合酶（PCR）,Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶，95孵育时的半衰期大于40分钟,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.3 聚合酶：复制核酸分子的酶,（4）反转录酶（病毒，依赖于RNA的DNA聚合酶）,反转录酶是以RNA为模版合成互补的DNA链（cDNA）,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.4 修饰酶：去除或添加化学基团的酶,（1）碱性磷酸酶（alk
8、aline phosphatase）,碱性磷酸酶：去除DNA分子5末端的磷酸基团,4.1 DNA操作酶的范围,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.4 修饰酶：去除或添加化学基团的酶,（2）多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）,多核苷酸激酶：在DNA分子5游离末端添加磷酸基团（活性正好和碱性磷酸酶相反）,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.4 修饰酶：去除或添加化学基团的酶,（3）末端脱氧核苷酸转移酶,末端脱氧核苷酸转移酶：在DNA分子3末端添加一个或多个脱氧核苷酸构建人工粘性末端，不需要模板,4.1 DNA操作酶的范围,4.1.5 拓扑异构酶：向共价闭合环状DNA中引入或
9、消除双螺旋的酶,限制性内切酶的发现和功能,限制性内切酶II在特定的核苷酸序列处切割DNA,DNA分子中识别序列的出现频率,在实验室条件下进行限制性酶切,对限制性内切酶的酶切结果进行分析,DNA分子大小的估计,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,通过作图标出一个DNA分子上的不同限制性位点,平末端和黏末端,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,准确,可重复,4.2.1 限制性内切酶的发现和功能,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,20世纪50年代,宿主调控性限制,4.2.1 限制性内切酶的发现和功能,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,1970年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内
10、切酶。,Werner Arber 理论预见限制酶,Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断,Hamilton O.Smith 得到第一个限制酶,1978年Nobel生理或医学奖,4.2.1 限制性内切酶的发现和功能,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,目前为止，在细菌中已经发现了1200多种限制性内切酶，分为三类：其识别位点与切割位点相距1000-5000bp，切割位点不表现严格的特异性；2条链上的断裂位点相距70-75个核苷酸；识别序列具有特异性，且序列为旋转对称性，切割位点位于限制性内切酶识别序列之内，限制性内切酶的功能核甲基化酶的功能分开；是基因工程中常用的内切酶
11、；由R、MS亚基共同组成，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰的双重功能；R亚基具有内切酶活性。切割位点位于识别位点的一侧若干碱基对处，无序列特异性，而只与识别位点的距离有关，从7-26bp不等。在与识别位点结合之后，修饰作用和限制作用取决于两个亚基之间的竞争。,限制性内切酶的分类,4.2.1 限制性内切酶的发现和功能,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,I和III型酶识别序列特点：一般具有内切酶和甲基化酶的活性，识别或切割位点不恒定，不具备用来做工具酶，II型酶识别序列特点：均有严格的识别特定核苷酸的序列，识别的核苷酸序列一般在48个碱基对 大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式,4
12、.2.1 限制性内切酶的发现和功能,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.2 限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割DNA,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.2 限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割DNA,命名：400余种II类酶，鉴定的识别和切割位点有300多种，商品化100多种，DNA重组技术中常用的有20多种。其命名书写规则：以生物体属名的第一个大写字母和种名的前2个小写字母构成酶的基本名称；若酶在一个特殊菌株上发现，则将株名的第一个字母加在基本名称之后；若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还用一个大写字母表示这些非染色
13、体的遗传因子；酶最后的部分为罗马字母，表明该生物发现此酶的先后顺序。如HindIII 表明在Heamophilus influenzae d菌株种发现的第3种酶；EcoRI 表明在Escherichia coli的抗药性R质粒上发现的第一个酶,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.2 限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割DNA,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.2 限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割DNA,II 型限制性核酸内切酶的基本特性,识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的1800旋转对称型回文结构,
14、5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.2 限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割DNA,回文结构,如HindIII AAGCTT TTCGAA HapII CCGG GGCC Cfr13I GGNCC CCNGG Eco81I CCTNAGG GGANTCC Not I GCGGCCGC CGCCGGCG,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.3 平末端和黏末端,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.3 平末端和黏末端,5 G-C-T-
15、C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.3 平末端和黏末端,同尾酶：有些来源不同的酶尽管其识别的序列不同，但是其切割出的DNA片段是有相同的粘性末端。,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.4 DNA分子中识
16、别序列的出现频率,理论上：GATC 每44=256个碱基 出现一次GGATCC 每46=4096个碱基 出现一次实际上识别位点发生的频率从要小一点（如识别6个碱基的BamHI，BglII，SalI）,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.4 DNA分子中识别序列的出现频率,限制性酶切位点通常称不会均匀分布于DNA分子中,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.5 在实验室条件下进行限制性酶切,如何做一个酶切反应：（1）2ug DNA 浓缩到125ug/ml（不高不低，纯）16ul（2）限制性内切酶 BglII（4U/ul）一个酶单位（U）定义为一定温度（通常为37度）下1小时内切
17、割1ugDNA所需要的酶量 2ug DNA 需要2U即 4U/ul X 0.5ul（3）缓冲液（buffer）10X,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.5 在实验室条件下进行限制性酶切,设计一个最普通的酶切体系总体系 20ul10buffer H 2ul切割的DNA分子 16ul限制性内切酶 BglII(4u/ul)0.5ulH2O 其余用H2O补齐体系 37 2小时,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.5 在实验室条件下进行限制性酶切,影响限制性内切酶活性的因素：酶活定义：指在最适反应条件下（因酶而异，包括最适反应温度，最适缓冲条件
18、），经过1小时反应将1ugDNA完全分解所需要的酶量，称为酶活单位；影响酶活的因素：DNA的纯度：限制性内切酶消化DNA底物的反应效率，很大程度上取决于所使用DNA本身的纯度，而DNA制剂中的某些物质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA以及SDS等都可以抑制酶的活性。如果DNA纯度不够，可以采用扩大反应体系来稀释杂质含量；酶切消化的反应温度：大多数限制性内切酶的标准反应温度是37，也存在许多例外条件，如BamHI30,AccIII60，TaqI 65;在实际试验中,甲基化和星号活性是很少的.大多数切不开都与自己的体系或者DNA质量有关.,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.6 对限制
19、性内切酶的酶切结果进行分析,标准电泳不能区分大小,凝胶电泳可区分大小,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.6 对限制性内切酶的酶切结果进行分析,表3-1 琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系琼脂糖凝胶浓度/（%）可分辨的线性DNA大小范围/（kb）0.3 6050.6 2010.7 100.80.9 70.51.2 60.41.5 40.22.0 30.1,更小的DNA片段区分可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，40%聚丙烯酰胺凝胶电泳区分1-300bp的片段实验室通常操作的DNA片段在0.5-10kb左右，所以一般使用0.8-1%的琼脂糖凝胶基因组则一般使用的的琼脂糖凝胶,4.2 切割
20、DNA的酶-限制性内切酶,4.2.6 对限制性内切酶的酶切结果进行分析,上样缓冲液：6上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青 FF，30%甘油。（40%蔗糖）,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.6 对限制性内切酶的酶切结果进行分析,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.6 对限制性内切酶的酶切结果进行分析,凝胶中DNA分子的可视化,EB在紫外照射下能把DNA分子显示出来Gelred，SYBR Green，Goldview等,放射自显影（检测极微量的DNA）,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.7 DNA分子大小的估计,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶
21、,4.2.8 通过作图标出一个DNA分子上的限制性酶切位点,4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶,4.2.8 通过作图标出一个DNA分子上的限制性酶切位点,4.3 连接-将DNA连接在一起,4.3 连接-将DNA连接在一起,4.3.1 DNA连接酶的作用模式,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,4.3 连接-将DNA连接在一起,连接方式：相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接,4.3 连接-将DNA连接在一起,4.3.2 黏末端可增加连接的效率,一般情况下，平末端只有黏末端连接效率
22、的1/10-1/100。,4.3 连接-将DNA连接在一起,4.3.2 黏末端可增加连接的效率,如何提高平末端的连接效率（1）提高DNA分子的浓度，增加末端接触的机会（2）例如，载体具有黏末端，DNA分子具有平末端，采取如下方法：,4.3.3 黏末端可增加连接的效率,DNA接头（linker）,4.3 连接-将DNA连接在一起,4.3.2 黏末端可增加连接的效率,寡核苷酸接头,4.3 连接-将DNA连接在一起,4.3.2 黏末端可增加连接的效率,寡核苷酸接头,4.3 连接-将DNA连接在一起,4.3.2 黏末端可增加连接的效率,通过附加同聚物反应产生黏末端,4.3 连接-将DNA连接在一起,平头末端的连接：,不同粘性末端的连接：,4.3 连接-将DNA连接在一起,普通连接反应的设计：总体系 10ul10buffer 1ulVector(3k;500ng/ul)1ulDNA fragment(500bp;50ng/ul)3ulLigase 0.5-1ulH2O2 加水至10ul反应在16度过夜,
