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1、基因测序及分析,人类基因组,线粒体基因组(16.6kb),核基因组(3200Mb),基因外序列,基因和基因有关序列,约10%,约90%,专一或中等重复序列,Non-coding DNA,假基因,内含子,基因片段,10%,90%,专一的或低拷贝数序列,中度至高度重复序列,2030%,7080%,分散重复序列,串联重复序列/成簇重复序列,约60%,约40%,蛋白编码基因,rRNA基因,tRNA基因,Coding DNA,序列测定的技术,杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法DNA 芯片法,经典方法:Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-Gilbert DN
2、A化学降解法(Maxam&Gilbert,1977),新技术方法:,与 PCR反应类似。反应体系中包含：模板 DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和测序引物；反应过程：变性复性延伸终止,Sanger双脱氧终止法,Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）,ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般1：34)。,*,少一个OH,脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较,Sanger第一步：加入复制终止剂,荧光检测探头,电泳，看谁跑得快,ddNTPs参与下的DNA复制,Sanger法测序产
3、物的平均链长取决于ddNTP：dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；“标记终止法”测序产物的平均长度可通过标记反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反应的ddNTP:dNTP来调整。,Sanger第二步：荧光检测,Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determination,DNA 带负电DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关,Analyzed Raw Data,除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。Trace diagrams are analyzed by base calling programs that use d
4、ynamic programming to match predicted and occurring peak intensity and peak location.Base calling programs predict nucleotide locations in sequencing reads where data anomalies occur.Such as multiple peaks at one nucleotide location,spread out peaks,low intensity peaks.,Maxam-Gilbert法,一个末端标记的DNA片段在几
5、组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。,碱基特异性化学切割反应：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐
6、条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。,G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。T+C反应：肼（低盐）C反应：肼（高盐）测定DNA长度250bp。,化学裂解法测定DNA的核苷酸序列,杂交法SBH（Sequencing by hybridization）用特定长度的具有所有可能碱基序列的寡核苷酸探针与未知序列的DNA片段杂交。根据某些探针形成的完全双链，推知目的DNA的碱基序列。,基因组测序,在大规模DNA测序中，目标DNA分子的长度可达上百万个bp。现在还不能直接测定整个分子的
7、序列，然而，可以得到待测序列的一系列序列片段。序列片段是DNA双螺旋中的一条链的子序列（或子串）。这些序列片段覆盖待测序列，并且序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。在一般情况下，对于一个特定的片段，我们不知道它是属于正向链还是属于反向链，也不知道该片段相对于起点的位置。另外，这样的序列片段中还可能隐含错误的信息。序列片段的长度范围3001000 bp，而目标序列的长度范围是3100万bp，总的片段数目可达上千个。DNA序列片段组装（sequence assembly)，又称序列拼接）的任务就是根据这些序列片段，重建目标DNA序列。如果能够得到DNA一条链的序列，那么根据互补原则，另一条链的序
8、列也就得到了。,DNA测序不能从染色体进行，首先必须克隆化，构建基因组的物理图谱。先构建片段DNA克隆(以YAC或BAC为载体)，并把克隆依染色体排序，这就是“染色体的克隆图”。依片段DNA克隆在染色体上所在的位置排序，可以得到相互重叠的一系列克隆，叫做“克隆重叠群”(contig)。选取有关的克隆进行DNA测序，就可以“拼装”出整个染色体或基因组的DNA序列。如果克隆片段太大仍不便于直接测序，则需通过亚克隆，构建更小的片段。另外一种方法是对所有相互重叠的亚克隆进行测序，然后直接通过计算机程序根据其重叠部分进行“拼装”。,完整基因组的测序过程一般包括三个步骤：（1）建立克隆的物理图谱：如酵母人
9、工染色体YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（Bacterial Artificial Chromosome）克隆等；（2）利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆的序列；（3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。,鸟枪测序法(shotgun sequencing)大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体（如M13噬
10、菌体）；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。,将DNA大片段切割成小片段的三种方法：限制性内切酶 超声波处理 DNA酶I降解(加Mn2+)在这三种方法处理前，DNA的纯化非常重要，要去除载体DNA或仅由载体DNA产生的片段。,DNA全序列,切成小段,小段和载体结合,结合后进行测序,Map fragments,Sequence overlappingfragments,Assembledsequence,基因组DNA序列测定示意图 通过随机剪切得到的大分子DNA片段克隆到载体上。绘制出这些重叠片段的图谱，并对重叠片段进行测序，通过“拼装”得到
11、基因组序列。另一种方法不是根据片段的染色体位置，而是根据其重叠部分进行“拼装”。,Sequence all fragments and assemble,鸟枪法测序的缺点,随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数据处理分析工作量大。高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。,引物步移策略将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。定向缺失克隆策略、染色体步查法等。,
